摘要
本实验室利用基因工程技术已经成功制备了两株含有纳豆激酶基因重组质粒的工程菌大肠杆菌ER2566和毕赤酵母GS115.本研究优化了两株基因工程菌的诱导表达条件,获得高效表达具有纤溶活性的纳豆激酶,制备特异性抗重组纳豆激酶的多克隆抗体,重组大肠杆菌和重组毕赤酵母所表达的纳豆激酶进行了分离纯化,及酶学性质研究,为纳豆激酶的工业化生产奠定了基础.(1)制备特异性抗重组纳豆激酶的多克隆抗体,用于检测表达蛋白的免疫学性质,证明表达的蛋白质正是我们所需要得到的纳豆激酶.(2)重组大肠杆菌所表达的纳豆激酶的分离纯化步骤包括:超声波破碎、硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100柱层析以及冷冻干燥.SDS-PAGE检测得到电泳纯的纳豆激酶,纯化倍数为35倍,纯酶比活为1147.54;重组毕赤酵母所表达的纳豆激酶的分离纯化步骤包括:硫酸铵分级沉淀、超滤膜过滤以及冷冻干燥.SDS-PAGE检测得到电泳纯的纳豆激酶,纯化倍数为15倍,纯酶比活为357.14.(3)研究了从两株工程菌中分离得到的重组纳豆激酶的酶学性质,两者性质基本一致,最适反应温度为35℃,酶的稳定性为在25℃下放置3h残存酶活力为100%,37℃下放置3h残存酶活为95%,60℃以上酶活迅速消失;最适反应pH为7.0~7.5,在pH7~8范围内酶活最为稳定,Hg<'2+>可导致酶的迅速失活,Co<'2+>、Mg<'2+>对酶有激活作用.(4)通过对接种量,诱导时间,pH及收获时间等条件的研究,确定了适合基因工程菌毕赤酵母GS115/pro-NK的最优发酵条件即:接种量为10%,初始pH7.0~7.5,对数生长前中期诱导,诱导后18h收获.在此条件下发酵上清液中NK含量可达50mg/L以上,酶活力达到45,000U/L,为工业化生产奠定下基础.
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