摘要
胶原蛋白酶(collagenolytic protease)是指能降解天然非变性胶原的一类酶.在医学研究中可用于治疗椎间盘突出症等,实验室研究中作为工具酶应用于细胞和器官的分离,基础研究中可应用于胶原结构的研究,工业开发中可应用于胶原分级降解以获得胶原多肽,具有重要的理论研究意义和应用研究价值.微生物和动物组织来源的胶原蛋白酶已经有广泛的研究,至少从不同细菌和真菌中获得40余种胶原蛋白酶,但由于它们大多来源于致病菌株,目前能够商业化生产的胶原蛋白酶的菌株很少.本实验从成都皮革厂等经常堆积废弃毛皮、皮革的场所采集土样,通过富集、初筛、牛皮消化试验和胶原蛋白酶活性测定等方法,获得12株具有胶原蛋白酶活性的菌株.通过形态观察、生理生化特征分析及BIOLOG微生物鉴定仪鉴定,分别鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudumonas aeraginosa)和火神发光杆菌(Photobacterium logei).根据胶原蛋白酶PAC-SubA亚基N末端测序结果和同源性分析,设计了PCR引物扩增出并克隆到SubA亚基的全基因.测序结果显示,该片段全长2011bp,编码区全长1494bp,该片段是一个完整的基因,命名为pacA基因.该基因编码的蛋白质序列包含有23个氨基酸残基组成的信号肽和174个残基组成的前肽序列.同源性分析表明,该基因序列与已经报道的铜绿假单胞菌PA01菌株弹性蛋白酶lasB基因序列同源性99%,推导成熟肽氨基酸序列完全相同.将含有pacA全基因的重组质粒转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),其转化子细胞经超声波破碎后,其上清液在明胶平板上可产生透明的水解圈;明胶SDS-PAGE显示出与预期大小一致的活性带;SDS-PAGE电泳不能检测到特异表达的蛋白质带,表明该基因表达量低;胶原蛋白酶活性测定显示,表达的SubA没有胶原蛋白酶活性.
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