摘要
【背景】急性胰腺炎是一种危害人类健康的常见外科疾病，重型急性胰腺炎病死率居高不下，其发病机理尚未阐明，仍是跨世纪的医学难题。 急性胰腺炎的疾病进程在临床上表现出极强的异质性，其高危人群的个体易感性以及对治疗反应的个体差异性是由致病因素、环境以及机体的免疫状态相互作用决定的，而机体免疫状态的个体差异源于个体遗传因素的差别。个体遗传因素中包括参与先天或获得性免疫反应的分子及识别受体的遗传多态性，这些遗传多态性可能影响急性胰腺炎的发生并与疾病进程相关联，还可能与急性胰腺炎进程中的特定并发症的出现相关联。 HLA是迄今所知最为复杂的遗传多态性系统，是调控人体特异性免疫应答和决定疾病易感性个体差异的主要基因系统。HLA-DR抗原是最主要的MHCⅡ类分子，在抗原识别、递呈、免疫应答与调控等方面起着非常重要的作用。决定其特异性的主要编码基因HLA-DRB1座位具有高度多态性，不同地域和种族人群HLA-DRB1等位基因频率分布的差异较大，并与多种胰腺疾病(糖尿病、胰腺癌和慢性胰腺炎等)相关联，但至今尚未见HLA-DRB1基因多态性与急性胰腺炎相关性的研究报道。 Toll样受体是生物进化过程中一种古老的天然免疫受体，不仅能识别外源性微生物，而且能识别内源性有害物质的刺激，产生不同形式与不同程度的炎症反应。免疫细胞通过TLR9识别CpGDNA激活细胞内信号转导，活化转录因子NF-kB，导致炎症介质大量释放，可引起急性炎症反应，甚至发展为全身炎症反应综合征(SIRS)。TLR9尽管是保守的先天性免疫系统的主要功能识别受体之一，但也存在基因变异和遗传多态性，且与哮喘等一些过度炎症相关联。而急性胰腺炎中胰腺的自身消化以及严重的过度炎性反应——SIRS是否也与TLR9的基因突变相关尚待澄清。 【目的】①建立HLA-DRB1SBT一步分型方法，通过对HLA-DRB1的基因分型，研究HLA-DRB1座位上的等位基因频率在成都地区汉族正常健康人群和急性胰腺炎人群的分布差异，旨在探讨与急性胰腺炎发生相关联的抗性和/或易感基因；另外，通过对成都地区汉族的轻型急性胰腺炎、重型急性胰腺炎二组患者的HLA-DRB1基因多态性的比较分析，探讨HLA-DRB1基因多态性对急性胰腺炎疾病进程的影响。②建立实时荧光定量PCR法检测TLR9基因在-1237位点的多态性，研究在正常健康人和急性胰腺炎病人之间，以及轻型急性胰腺炎病人与重型急性胰腺炎病人之间，是否存在TLR9核苷酸序列的差异，同时探讨TLR9的基因突变与急性胰腺炎疾病进程的关系。 【方法】①样本来源：成都地区汉族急性胰腺炎病人131例(轻型急性胰腺炎67例，重型急性胰腺炎64例)作为实验组，正常健康人90例作为对照组。②改进SBT基因分型技术，建立准确高效的PCR-STAmp法进行HLA-DRB1基因分型，获得成都地区汉族正常健康人群和急性胰腺炎人群HLA-DRB1的基因分布频率，利用POPGENE统计软件对正常健康人群进行H-W平衡分析，卡方检验分析HLA-DRB1座位上的等位基因频率在成都地区汉族正常健康人群和急性胰腺炎人群的分布差异，并进一步对轻型急性胰腺炎、重型急性胰腺炎二组患者的HLA-DRB1基因多态性进行比较分析。③采用实时荧光定量PCR法(SYBR-GreenⅠ荧光染料DNA结合染色法)检测TLR9基因在-1237位点的多态性，比较分析TLR9基因在-1237位点的等位基因频率在正常健康人和急性胰腺炎病人之间，以及轻型急性胰腺炎病人与重型急性胰腺炎病人之间，是否存在分布差异。 【结果】①通过病例-对照研究，HLA-DRB1*0406和HLA-DRB1*1405等位基因在急性胰腺炎组的分布频率显著性高于正常对照组(HLA-DRB1*0406：P=0.03＜0.05，RR=3.05＞1，95％CI＞1；HLA-DRB1*1405：P=0.04＜0.05，RR=7.84＞1，95％CI＞1)，差异有统计学意义。②HLA-DRB1*0411等位基因在正常对照组的基因频率分布显著性高于急性胰腺炎组(P=0.03＜0.05，RR=0.17＜1，95％CI＜1)，差异有统计学意义。③与重型急性胰腺炎组相比，HLA-DRB1*1101等位基因在轻型急性胰腺炎组的分布频率较高(P=0.03＜0.05，RR=0.45＜1，95％CI＜1)，差异有统计学意义。④本研究对TLR9基因多态性(-1237)的荧光PCR检测结果显示，C等位基因频率在急性胰腺炎组的分布(15.3％)高于正常对照组(10.6％)，C等位基因频率在重型急性胰腺炎(SAP)组的分布(18.9％)亦高于轻型急性胰腺炎(MAP)组(11.9％)，但经统计学分析，上述差异均无显著性(P＞0.05)。⑤在重型急性胰腺炎病人中，与无继发感染组(15.8％)相比，继发感染组(23.9％)的TLR9基因-1237位点的C等位基因频率有增高趋势，但无显著性差异(P＞0.05)；与无继发全身炎症反应综合征组(7.9％)相比，C等位基因频率在继发全身炎症反应综合征组(23.3％)明显增高，差异具有显著性(P＜0.05，OR=3.01＞1，95％CI＞1)。 【结论】①PCR-STAmp法改进了繁琐的传统SBT技术，具有高特异性、高分辨率和高效率的特点，并成功应用于HLA-DRB1基因分型，该方法在国内尚未见报道，值得推广应用。②本研究首次对成都地区汉族群体HLA-DRB1基因与急性胰腺炎的关联进行了研究，发现HLA-DRB1*0406和HLA-DRB1*1405可能为成都地区汉族群体急性胰腺炎的易感基因，HLA-DRB1*0411可能为成都地区汉族群体急性胰腺炎的抗性基因，而HLA-DRB1*1101则可能为成都地区汉族群体急性胰腺炎疾病进程中具有保护作用的抗性基因。③本研究首次对TLR9基因与急性胰腺炎的关联进行了研究，发现TLR9-1237位点的单核苷酸多态性(SNP)可能与重型急性胰腺炎继发全身炎症反应综合征有关。TLR9-1237位点的C等位基因可能为重型急性胰腺炎病人继发全身炎症反应综合征的易感基因。本次实验未发现TLR9-1237位点的多态性与急性胰腺炎发生的遗传易感性有关。
NETL