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体外压应力下髁突软骨细胞早期应答机制的蛋白质组学初探
李煌1
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摘要
髁突软骨是口腔颞下颌关节的重要结构，其所具有的生物学特性是口腔正畸功能矫形治疗的基础。作为髁突软骨主要的细胞成分，髁突软骨细胞在维持细胞外基质的完整、适应外周环境刺激以及功能性改建等方面都具有相当重要的作用。 在口腔功能矫形治疗中，压应力是导致髁突软骨改建的关键而敏感的力量之一。压应力作用下，髁突软骨细胞是如何识别应力信号并发生生物应答反应?这一力学信号转导的具体机制仍尚不清楚。因此，压应力作用下髁突软骨细胞早期应答机制的研究已成为口腔科学乃至力学信号转导研究的热点。 力学信号的识别和传递本质上是一系列蛋白质的变化。比较两种不同力学状态下髁突软骨细胞的蛋白质，有助于阐明压应力作用下髁突软骨细胞早期生物学应答反应，发现关键的应力信号转导蛋白分子。蛋白质组学(Proteomics)作为高效率，高通量的蛋白筛选技术，为力学信号转导机制的研究提供了新的思路。蛋白质组学的出现改变了以前只能研究单个蛋白质的状况，建立了以整体观点来解析生命现象的理念，以蛋白质组为基础的生物信息学和实验科学相结合为研究压应力下髁突软骨细胞的早期应答机制提供了一种新的尝试。 本课题体外培养大鼠髁突软骨细胞，利用四点弯曲细胞力学加载装置(Four-PointBendingSystem)对髁突软骨细胞进行压应力加载，从蛋白质组学的角度对所发生的早期应答反应进行了初步的探讨。运用体外培养技术获得具有稳定生物学表型的髁突软骨细胞；运用流式细-5-胞术、MTT方法观察髁突软骨细胞增殖活性的变化；运用蛋白质组学的核心技术——双向电泳技术和基质辅助激光解吸飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)分离髁突软骨细胞的全细胞蛋白质并找出感兴趣的差异蛋白质点，对差异蛋白质点进行肽指纹图谱鉴定；根据质谱鉴定结果，运用免疫荧光和激光共聚焦显微镜技术观察细胞骨架的变化情况；运用Westernblotting免疫印迹技术对肌动蛋白(actin)、中间丝波形纤维(vimentin)、应激70糖调控蛋白(Stress-70protein/GRP75)以及Raf激酶抑制蛋白(Rafkinaseinhibitorprotein，RKIP)不同时间点的变化进行观察，并对RKIPmRNA进行荧光实时定量PCR检测。 根据实验观察得出以下结果： 1.体外培养的大鼠髁突软骨细胞为单层贴壁生长，形态呈多角形或星形，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性。 2.2000μstrain压应力作用下，髁突软骨细胞增殖活性60min内没有明显变化，但120min后S期细胞比例逐渐增长；4000μstrain压应力作用下，髁突软骨细胞周期受到影响，60min出现了一明显的S期抑制。停止加力后，两组细胞增殖活性都恢复正常。 3.双向电泳结果表明，2000μstrain压应力作用60min后，髁突软骨细胞的蛋白斑点量的改变无显著差异；而4000μstrain压应力作用下蛋白斑点有明显差异，29个点表达量发生变化，其中22个点表达下调。 4.对4000μstrain压应力作用下的部分蛋白质点进行质谱分析，鉴定出一批差异蛋白质，包括信号转导相关分子RKIP/PEBP，细胞骨架相关蛋白actin、Vimetin/Rho-GTP酶；糖代谢相关蛋白-6-烯醇酶α、10-甲基四氢叶酸脱氢酶以及应激70糖调控蛋白。 5.4000μstrain压应力作用下，细胞骨架蛋白actin、vimentin、糖调控蛋白Stress-70/GRP75早期表达下调，随着压力加载时间延长三种蛋白表达均恢复上调，部分蛋白表达强于对照。 6.4000μstrain压应力作用下，RKIPmRNA和蛋白水平变化并不一致。RKIP蛋白早期表达下调，但RKIPmRNA表达水平增高；而在压力加载后期，两者出现了相反的变化趋势。 本研究结论如下：1.体外培养的第三代大鼠髁突软骨细胞生物学特性稳定，组织来源可靠，可以满足本课题实验的后续研究。 2.2000μstrain压应力作用下髁突软骨细胞蛋白蛋白斑点量的改变无显著差异，提示该力值可能接近生理水平下的流体静压力；4000μstrain压应力作用下髁突软骨细胞蛋白斑点表达量有明显差异，提示该力值是能使髁突软骨细胞发生应答反应的合适机械刺激。 3.4000μstrain压应力刺激下，髁突软骨细胞的早期应答涉及不同蛋白质分子，其中细胞骨架蛋白、能量代谢相关蛋白、信号通路蛋白可能在早期应答反应中起到较为重要的作用。 4.4000μstrain压应力刺激下，髁突软骨细胞早期应答首先表现为以抑制反应为主，但随着加力时间延长，细胞发挥“自我保护调控”(self-regulate)机制，发生下调的蛋白恢复表达或反馈性增强。 -7-5.细胞骨架蛋白Actin、Vimentin不仅对力学刺激作出反应，也参与了力学信号的传递。机械力学信号可能通过细胞骨架转化为生物化学信号，激活不同的信号通路，信号分子再反馈调控细胞骨架蛋白。 6.Stress-70/GRP75的蛋白变化提示，压应力早期髁突软骨细胞线粒体功能可能受到暂时性抑制，能量供给不足，细胞代谢水平降低，这可能是蛋白大部分下调的首要原因。 7.作为机体信号通路内源性抑制者，RKIP可能是压应力作用下信号转导的关键分子，它和MAPK级联信号通道、细胞骨架关系密切，共同发挥调控作用。
关键词
髁突软骨细胞/压应力/基质辅助激光解吸飞行时间质谱/蛋白质组学/双向电泳/口腔临床医学/正畸功能矫形引用本文复制引用
授予学位
博士学科专业
口腔临床医学导师
陈扬熙学位年度
2005学位授予单位
四川大学语种
中文中图分类号
R78