摘要
目的表皮生长因子受体(EGFR)是CerbB1/EGFR基因编码的Src家族跨膜受体酪氨酸激酶，由胞外段，跨膜段及胞内激酶活性段构成。其胞外段的主要功能是结合表皮生长因子EGF等配体介导受体同源二聚化，或者与同族其它的受体如erbB2等异二聚化，进而激活胞内段酪氨酸激酶活性，启动EGFR通路信号传递。目前EGFR胞外段已成为EGFR阳性表达的肿瘤免疫治疗的重要标靶。本实验通过分子克隆技术实现异种同源表皮生长因子受体EGFR胞外段在毕赤巴斯德酵母中的分泌性表达，并通过基因工程纯化得到异种同源的重组EGFR蛋白疫苗，对家兔和荷瘤小鼠进行免疫，探讨以EGFR为靶向激发EGFR特异的抗肿瘤主动免疫反应的可行性。方法将鼠和人的EGFR胞外段目的基因(mer，her)与分泌型毕赤酵母表达载体pPICZαA重组，构建了相应的重组表达质粒pPICZαA-mer和pPICZαA-her，用SacI将重组质粒线性化后，电穿孔转化酵母菌株GS115，利用Zeocin筛选阳性克隆，挑出阳性克隆用甲醇小规模诱导表达后，进行SDS-PAGE分析及Western-blot检测，筛选高表达量的克隆作大规模诱导表达。分离纯化得到重组蛋白EGFR，并用SDS-PAGE分析及Western-blot鉴定。在C57BL/6小鼠皮下注射肿瘤细胞hepal-6，建立小鼠肝癌模型，用重组蛋白EGFR与复方氢氧化铝佐剂的混合物作为蛋白疫苗对荷瘤小鼠进行免疫治疗。并用重组蛋白mEGFR与复方氢氧化铝佐剂的混合物免疫家兔，以制备大量兔抗鼠的抗体，为后续裸鼠实验打基础。结果获得了鼠和人的EGFR胞外段目的蛋白在毕赤巴斯德酵母中的分泌性表达，SDS-PAGE分析及Western-blot检测得到预期条带，相对分子质量约为95×103。免疫印迹分析表明，表达蛋白具有良好的抗原性和特异性。在建立的小鼠肝癌模型中用该重组蛋白作为疫苗进行免疫，接种肿瘤细胞3天后开始注射疫苗，每周1次，共4次，可见到一定的肿瘤抑制效应。获得高滴度的兔抗鼠的抗体，体外A431细胞抑制实验显示抗体有良好抑制效应。结论pPICZαA-mer和pPICZαA-her重组质粒在甲醇营养型酵母中可经甲醇诱导表达鼠和人的EGFR胞外段目的蛋白。应用基因工程方法制备纯化出的重组蛋白EGFR，可在小鼠体内诱导出一定的抗肿瘤效应，是一种有效的特异性主动免疫方法。用重组蛋白mEGFR免疫家兔，得到的大量兔抗鼠的抗体，体外抑制实验有效。提示在酵母表达系统中得到的该重组蛋白，在肿瘤免疫治疗方面可能具有重要价值，有进一步研究和发展的潜力。
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