摘要
本文研究了农杆菌介导番茄和牛膝的遗传转化及霸王组培再生，全文共分为三部分： 1.利用发根农杆菌A4，9402Bin19，ATCC15834三个菌株感染怀牛膝的叶切片和茎段外植体，获得毛状根转化体，并筛选了优质株系。三个菌株诱导毛状根的频率明显不同，ATCC15834的转化频率最高，为60％～80％，A4的转化频率为40％～55％，9402Bin19的转化频率最低，为30％～40％。且叶切片外植体的转化频率高于茎段外植体。ATCC15834菌株诱导牛膝产生的毛状根可在无任何激素的MS培养基上快速生长，且具有分枝性强、丛生、无向地性等特点。通过对液体培养条件的选择，发现牛膝毛状根在MS液体培养基上(25℃、110r/min暗培养)获得最大生长速率，经25d培养，牛膝毛状根鲜重增加了8.4倍。利用高效液相色谱法测定毛状根中齐墩果酸含量发现，发根系w02中齐墩果酸含量达到25.59mg/g，超过栽培一年生牛膝根中齐墩果酸量(14.73mg/g)。用高压纸电泳方法在牛膝毛状根中检测到甘露碱的存在。PCR反应证明：本研究获得的牛膝毛状根确已被ATCC15834菌株Ri质粒的T-DNA所转化.并被整合到毛状根牛膝DNA上。利用ATCC15834菌株诱导牛膝产生的毛状根在附加在1.5mgL-12,4-D，0.5mgL-16BA的MS培养基上，经过两周就可诱导出愈伤组织。当愈伤组织转移到附加1.0mgL-16BA，0.5mgL-1NAA的MS培养基上后分化出大量芽。所有这些芽能够进一步生长，并且在含有1.0mgL-1IBA的MS培养基上诱导生根，长成小植株。 2.以番茄“早魁”品种为材料，通过对子叶切块和茎段培养，建立了番茄组织培养的再生体系，为番茄的遗传转化提供了良好的受体系统；通过根癌农杆菌介导，将内抑素基因导入番茄，得到了转化再生植株。对再生植株PCR以及RT-PCR检测结果均呈阳性，从而初步建立了番茄的遗传转化体系。 3.以霸王(ZygophyllumxanthoxylonMaxim)的叶基切段为外植体进行离体培养。在附加2mgL-12,4-D，0.2mgL-16BA的MS培养基上诱导出愈伤组织。当愈伤组织转移到附加1mgL-16BA，0.5mgL-1NAA的MS培养基上培养后分化出大量的苗。分化苗在含有1mgL-1KT的MS培养基上诱导生根。细胞学观察表明，再生植株的染色体数正常，为2n=22；但RAPD分析显示，在再生苗中出现了一条约800bp的特异性条带，表明在组织培养过程中，DNA分子水平上有一定的变化。对再生植株的茎切段在含1mgL-1KT的MS的培养基上作扦插繁殖，亦得到大量的生根苗。再生植株移栽土壤后，成活率在90％以上。同时，对其RAPD反应进行了条件优化分析，通过单因子实验分别研究了Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq酶的浓度、引物浓度和模板DNA浓度对RAPD反应的影响，即在30μl总反应体系中，Mg2+的适宜浓度为1.5～2.5mmol/L、dNTPs的适宜浓度为0.2～0.3mmol/L、随机引物的浓度以1.2μmol/L为宜、Taq酶的用量以2.0U为佳、模板DNA的最适用量为50ng。
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