摘要
在已婚人群中有将近15％的夫妇存在着不育，而其中近一半是由男性因素引起的。引起男性不育的病因大致可分为：睾丸前性，睾丸性和睾丸后性，睾丸性病因中主要是遗传因素。而目前遗传因素中研究较多的是Y染色体。已经知道：在男性的性别分化中Y染色体起着非常重要的作用，Y染色体短臂上含有性别决定基因(sex-determingregionYgene，SRY)。现发现Y染色体异常与男性不育有非常密切的关系，无论Y染色体数目异常还是结构异常均可导致男性不育。在Y染色体数目异常中主要是Y染色体减少或增多以及各种异常核型的嵌合体，它们都可表现为男性生育力下降以致不育。在Y染色体结构异常中，目前研究较多的是Y染色体基因缺失与男性不育的关系。已发现Y染色体上存在着精子生成基因或基因家族，称为无精子因子(azoospermiafactor，AZF)，目前发现在Y染色体长臂上至少存在AZFa、AZFb、AZFc、AZFd四个区域，这些区域的微缺失与男性不育有着密切关系。 虽然引起男性不育的已知原因较多，但目前男性不育的病因仍不清楚。在男性因素引起的不育原因中无精子症大约占了10％。在无精子症不育男性中睾丸组织学检查发现近一半属于特发性睾丸精子发生缺陷，精子发生缺陷的程度从精子发生的完全缺乏即唯支持细胞综合症(sertolicell-onlysyndrome，SCOS)到精子发生部分缺陷，也就是精子成熟阻滞(maturationarrest，MA)和精子发生程度相对较高的精子发生低下(hypospermatogenesis，Hypo)。促卵泡激素(folliclestimulatinghormone，FSH)是一种垂体的糖蛋白激素，它对子维持男性和女性的正常生育功能是必需的。在男性中，FSH决定了睾丸中支持细胞的数量以及精子发生的数量和质量。因此，FSH被认为是促使精子发生和成熟的最重要的激素，其血清水平异常可能反映了睾丸内精子发生存在障碍。FSH受体(FSHR)表达子支持细胞的浆膜上。FSH通过结合FSHR后激活G蛋白偶联机制而起作用。FSH受体信号对刺激支持细胞的增殖以及维持睾丸正常的精子产生是必需的。 尽管研究已发现AZF区域微缺失与无精子症、严重少精子症有密切关系，但AZF区域微缺失与无精子症患者的睾丸组织学表型之间的关系仍不明确，与无精子症患者的血清促卵泡激素(FSH)水平的关系也不清楚。尽管已经明确FSH及其受体信号对维持睾丸正常的精子产生是必需的，而且也已发现FSH受体结合能力的下降与男性不育相关，但至今仍不明确FSHR在特发性无精子症患者睾丸组织中的表达水平，与精子发生程度是否存在相关性，以及无精子症患者血清FSH水平与睾丸内精子存在与否的对应关系。为了弄清这些问题，我们检测了特发性无精子症患者的血清FSH水平、Y染色体AZF区域微缺失、睾丸的精子发生程度以及FSHR在不同睾丸组织学表型中的表达水平，在此基础上，探索了Y染色体AZF区域微缺失与血清FSH水平、睾丸的精子发生程度的关系，FSHR在睾丸组织中的表达水平与精子发生程度的相关性，以及血清FSH水平与睾丸内精子存在与否的对应关系。 第一部分特发性无精子症患者Y染色体基因微缺失研究研究 目的:明确特发性无精子症患者Y染色体基因微缺失与睾丸组织表现型之间的关系；明确特发性无精子症患者Y染色体基因微缺失与血清促卵泡激素(FSH)水平的关系。 研究对象和方法:2002年3月至2005年12月间来我院不孕不育门诊就诊的特发性无精子症患者共126例，其中正常血清FSH水平90例，高血清FSH水平36例。对照组：正常已生育的男性及正常女性各20例。患者外观正常，睾丸大小正常，均未患过睾丸炎、附睾炎、未服用过棉籽油、染色体核型正常；无其他内分泌疾病史及遗传性疾病史。精液常规检查根据WHO标准连续2次无精子，诊断为无精子症。血清激素黄体生成素(luteinizinghormone，LH)，雄激素(testosterone，T)均在正常范围。抽取各组新鲜外周静脉血3ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离得到淋巴细胞后，使用DNA提取纯化试剂盒(Promega公司)进行淋巴细胞裂解，核裂解，去除RNA、蛋白，分离沉淀DNA，三蒸水溶解稀释，得到基因组DNA。基因组DNA提取后行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪观察是否存在Y染色体基因微缺失。在征得患者同意后，在患者的一侧睾丸，用开窗手术取得大约0.4×0.4×0.4cm3大小睾丸组织，分成2部分，一部分送病理检查，判断睾丸组织病变类型；另一部分则在显微镜下观察有无精子，然后放入清洁密封试管中，-80℃下冻存。 结果:90例正常血清FSH无精子症不育男性中发现6例存在Y染色体序列标记位点(sequencetaggedsites，STSs)的微缺失，缺失率为6.7％(6/90)，缺失形式有3种，分别为AZFa(SY82)、AZFa(SY82)+AZFb(SY109+SY131)以及AZFc(SY152+SY254+SY255)，其中3例为单纯的AZFa(SY82)微缺失，2例为AZFc(SY152+SY254+SY255)微缺失，1例为AZFa(SY82)+AZFb(SY109+SY131)微缺失。6例存在缺失的患者中4例睾丸活检镜下见到精子，睾丸病理检查结果提示轻度的睾丸精子发生低下，而2例未见精子患者睾丸病理检查结果提示精子成熟阻滞。在36例高血清FSH无精子症患者中，共检出微缺失9例，缺失率达25.0％，缺失形式有5种，分别为AZFc(SY152)、AZFc(SY152+SY254)+AZFd(SY153)、AZFc(SY152+SY254+SY255)+AZFd(SY153)、AZFc(SY152+SY158+SY255)+AZFd(SY153)、AZFb(SY130)+AZFc(SY158+SY254+SY255)+AZFd(SY153)，其中1例患者为AZFc(SY152)缺失，4例为AZFc(SY152+SY254)+AZFd(SY153)缺失，2例为AZFc(SY152+SY254+SY255)+AZFd(SY153)缺失，1例为AZFc(SY152+SY158+SY255)+AZFd(SY153)缺失，最后1例为AZFb(SY130)+AZFc(SY158+SY254+SY255)+AZFd(SY153)。存在缺失的9例患者，其睾丸活检组织显微镜下有3例见到精子，睾丸病理检查结果提示轻度的睾丸精子发生低下，而6例未见精子患者中，5例睾丸病理检查结果提示精子成熟阻滞，1例提示唯支持细胞综合症。高血清FSH无精子症患者Y染色体微缺失率明显高于正常血清FSH水平患者(P=0.01)。精子发生低下的无精子症患者可以存在AFZa、AZFb区的微缺失，也可存在AZFc、AZFd区的微缺失；精子成熟阻滞的无精子症患者也可以存在AZFb、AZFc或AZFd区的微缺失。 结论:1.Y染色体基因微缺失是正常和高血清FSH无精子症患者患病的重要原因之一。2.特发性无精子症患者Y染色体基因微缺失类型与其睾丸组织表现型之间无确定的对应关系。3.特发性无精子症患者血清FSH水平与Y染色体微缺失发生率相关。 第二部分促卵泡激素受体在特发性无精子症患者不同睾丸组织学表型中的表达 研究目的:明确特发性无精子症患者血清FSH水平以及睾丸组织中FSHR的表达水平与精子发生程度是否存在相关性以及在不同的睾丸组织学表型中是否存在不同的FSHR的表达水平。 研究对象和方法:2002年3月至2005年12月间来我院不孕不育门诊就诊的特发性无精子症患者共57例。患者外观正常，睾丸大小正常，均未患过睾丸炎、附睾炎、未服用过棉籽油、染色体核型正常；无其他内分泌疾病史及遗传性疾病史。精液常规检查根据WHO标准连续2次无精子，诊断为无精子症。患者血清激素应用电化学发光法进行测定，黄体生成素(LH)，雄激素(T)均在正常范围。在征得患者同意后，在患者的一侧睾丸，用开窗手术取得大约0.4×0.4×0.4cm3大小睾丸组织，分成2部分，一部分送病理检查，判断睾丸组织病变类型；另一部分放入清洁密封试管中，-80℃下冻存。57例无精子症患者睾丸病理组织学诊断分为三组：精子发生低下(Hypo)25例，精子成熟阻滞(MA)21例，唯支持细胞综合症(SCOS)11例。对照组：睾丸组织学诊断精子发生正常13例。对各组标本行实时荧光RT-PCR法(Real-timeRT-PCR)测定FSHRmRNA的表达，并进行相对定量分析。取各组标本石蜡切片用二步法免疫组织化学法检测FSHR蛋白的表达，明确其组织学定位，并用H-score组织学积分法对FSHR蛋白表达进行半定量分析。 结果:睾丸病理组织学诊断SCOS的无精子症患者组的血清FSH水平明显高于其他三组：Hypo组、MA组和正常精子发生组(P＜0.01)，组织学诊断MA的患者组的血清FSH水平明显高于Hypo组和正常精子发生组(P＜0.05)，而Hypo组和正常精子发生组之间FSH水平无明显差别(P＞0.05)。经Real-timeRT-PCR法和二步法免疫组织化学法检测均发现睾丸组织学诊断SCOS的无精子症患者组的FSHR的表达水平明显高于其他三组：Hypo组、MA组和正常精子发生组(均P＜0.05)，而在这三组之间FSHR的表达水平无明显差异(P＞0.05)。
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