摘要
本文在前人已有的工作基础上，应用生理、生态和分子生物学相结合的方法，研究确定了粘虫Mythimnaseparata(Walker)迁飞与生殖的关键时期及其在进化上的适应意义，明确了可对关键时期起作用的三种环境因子及其相应的作用，确定了保幼激素(JH)释放量的增加是迁飞个体转化为居留个体的主要原因，克隆和鉴定了对JH具有调控作用的粘虫促咽侧体激素(Mytse-AT)基因，并获得了该基因编码区的全序列，明确了Mytse-AT基因的半表达量和相对表达量与JH滴度的关系，得到了对粘虫具有生物活性即可以对其关键时期起作用的AT重组蛋白，为全面阐明粘虫的迁飞行为机制提供了新的科学依据，为深化昆虫迁飞研究的理论与应用实践开辟了新的途径。主要的研究结果如下： 研究确定了粘虫迁飞个体转化为居留个体的关键时期及其在进化适应中的意义。以迁飞个体的产卵前期较长飞行能力越强的理论为依据，对室内诱导的迁飞个体羽化后的不同时期进行饥饿处理的结果表明，成虫羽化后的24-30小时内进行超过12小时的饥饿，可以使处理成虫的求偶和产卵前期缩短，产卵量增加，而在其它时间进行处理则没有这种效果。表明成虫羽化后的24小时是粘虫迁飞与生殖调控的关键时期。即在成虫羽化前的发育过程中形成的迁飞行为在羽化以后的24小时内依然可以改变。但是，同样的环境因子对不同发育阶段的居留型成虫个体则没能产生相同的影响作用：羽化后24小时处理的成虫与2、3日龄处理的产卵前期虽然比对照的有所延长，但1-3日龄之间的处理并没有显著差异，另外，1日龄处理的产卵量及寿命等与对照的也没有显著的差异。这些结果表明，虽然迁飞个体可以在可操纵因素的影响下向非迁飞个体转变，非迁飞个体转化为迁飞个体的过程可能是不可逆的，因此，迁飞个体要比居留型的生活史弹性要强。这些结果较好地回答了迁飞种群较非迁飞种群的适应能力更强的问题。 研究明确了对关键时期可以起作用的一些环境因子及相应的影响作用。进一步就低温、光照等环境因子对处于不同发育阶段的迁飞个体进行处理的结果也表明，光照和低温与饥饿处理一样，对羽化后24小时内的迁飞个体的产卵前期具有影响作用，即可以显著地缩短成虫的生殖前期，并使产卵量增加。这样，低温和光照处理处理都可以使迁飞个体转变为生殖个体，但对羽化24小时以后的成虫进行同样的处理则对其产卵前期没有影响，表明处于关键时期的迁飞成虫个体对于来自不同的环境生理因子的刺激十分敏感。但是，这些环境因子的刺激必须要达到一定的程度才能产生作用：温度必须在5℃的条件下才能发生作用，而在10℃和15℃的条件下没有作用；饥饿则必须大于6小时才会发生作用，光照只有在24小时长光照的条件下才能发生作用，而在24小时全黑暗或在短光照的条件下没有作用。但是，相同强度的低温和光照对居留型相同时期进行的处理则没能改变其产卵前期或产卵量，即处理与对照的没有显著差异。这些结果的获得再次表明，居留型个体的生活史弹性或对环境的适应能力比迁飞型的要弱，因为迁飞个体在羽化后的24小时内，如果遇到低温或找不到补充营养，就可放弃迁飞而留在本地生殖，而其生殖能力不会受到影响，但居留型个体无论环境条件如何变化，都只能留在本地生殖。这些结果对于阐明粘虫迁飞行为的发生规律提供了更进一步的科学依据。 研究明确了JH提前分泌是上述环境因子使迁飞个体转变为滞留个体的主要原因。为了阐明主要环境因子对关键时期的影响作用机制，应用传统的研究思路对处理过的1日龄成虫的卵巢发育、飞行肌降解程度、飞行能力以及保幼激素的变化规律进行了研究。所获的结果表明，经饥饿处理的迁飞型初羽化成虫卵巢发育速度明显加快，处理后24-144小时的卵巢发育级别一直显著高于对照的；处理成虫中胸背纵肌重量在处理后的72小时内与对照的没有显著差异，但在96小时后明显低于对照的，到120小时后差异达到显著水平，表明处理成虫的飞行肌降解速度显著加快；处理后24-72小时成虫的飞行能力没有显著差异，但在96-144小时的飞行能力显著低于对照成虫的，这与飞行肌降解的水平相一致；经饥饿处理后的成虫二种JH(JHⅠ和JHⅡ)滴度也有较大的差异，JHⅠ在羽化后120小时之间差异不明显，但到144小时后差异十分明显。JHⅡ不同日龄之间差异较大，羽化后24h内的滴度明显低于其它日龄。处理后24小时，JHⅡ与对照的即产生明显的差异，到处理后的120h，差异达到最大。表明JHⅡ可能是控制粘虫卵巢和飞行能力的发育、飞行肌降解的主要内分泌调控因子。这样，由于已经明确粘虫的卵巢和飞行能力的发育，以及飞行肌的降解都受JH的调控，而本文所得的结果又与已有的研究结果相一致，因而可以认为，迁飞个体的咽侧体(CA)在初羽化时是没有活性的，但由于饥饿、低温等环境因子的刺激，初羽化迁飞个体的咽侧体得到了活化，从而使得JH提前释放是导致迁飞个体转化为居留个体的主要原因。 研究获得了对JH释放具有调控作用的粘虫促咽侧体激素(Mytse-AT)基因编码区的全序列。虽然上述研究阐明了JH是导致粘虫迁飞个体转变为居留个体的主要内分泌因子，但是对粘虫JH释放具有调控作用的因子目前并不清楚。为此，以雌蛾脑cDNA为模板，应用分子生物学方法获得Mytse-AT基因之后，经序列分析确定了编码区全长为411bp，编码区为136个氨基酸，分子量为15.385KD，等电点为5.245的Mytse-AT基因。成熟的Mytse-AT多肽位于第39至52个氨基酸残基。其序列和纯化的Manse-AT多肽及烟草天蛾的AT基因预测的氨基酸序列完全相同。该基因与其近源种，一点粘虫Pseudaleciaunxipunxcta的AT前体蛋白基因的同源性高达97％。虽然Mytse-AT基因的全部功能并没有明确，但由于已经知道Manse-AT多肽具有促进鳞翅目昆虫分泌JH的作用，再加上前体中成熟的AT多肽的氨基酸序列也与已知的烟草天蛾AT多肽氨基酸序列同源性达100％，据此初步认为，初羽化的粘虫迁飞个体的AT以及CA都没有活化，当粘虫脑受到外界环境因子的刺激后，Mytse-AT基因表达的活性物质激活了咽侧体，并开始分泌JH，从而使迁飞个体转化为居留个体。但更深层次的机理依然需要进一步的研究。 研究明确了Mytse-AT基因的表达量与JH滴度的动态关系。为了验证Mytse-AT基因在成虫期的表达水平是否与JH滴度的变化水平相吻合，应用半定量RT-PCR和适时荧光定量PCR对经过低温处理的迁飞个体进行了分析。所获的结果表明，半定量RT-PCR分析的结果与JH滴度水平的吻合程度较高，对照成虫羽化后24h、72h内的表达量极低，羽化后48h略有一些表达量，大量的表达则出现在羽化后96-144h之间，而对于经过饥饿处理的成虫而言，相同时间的Mytse-AT表达量均大于对照的，其中以处理后96h的表达量最大，第120h减少。用适时荧光定量PCR分析所得的结果与血淋巴内JH以及半定量RT-PCR分析的结果也比较一致，除了经过饥饿处理的成虫没有像JH滴度和半定量分析的那样在羽化后120h出现较大的峰值。Mytse-AT基因的表达量与JH，尤其是JHⅡ滴度的时序变化相一致的结果表明，1日龄饥饿对于AT基因的表达量具有明显的促进作用。综合分析的结果说明，在羽化后最初几天，AI表达量的变化和JH的滴度基本上是呈正相关，正是由于AT蛋白量的增加，激活了CA，并使其合成和释放JH滴度的速度增加，从而使迁飞个体转化为居留型个体。 根据Mytse-AT基因的序列特征设计了一对特异性引物，并优化了蛋白纯化的步骤和方法，获得了对粘虫关键时期或对CA具有活性或可以提高JH滴度的AT外源重组蛋白。主要的证据是：AT外源重组蛋白的使用可以显著地缩短粘虫迁飞个体的产卵前期，而使用空载体或丙酮处理的成虫与对照的没有显著差异；上述章节已经明确，粘虫的产卵前期或卵巢发育的速度均受到JH的调控，Mytse-AT基因的时序表达量与JH滴度的动态关系紧密相关。对粘虫具有生物活性的Mytse-AT外源重组蛋白的获得，标志着我国粘虫迁飞行为发生与调控的研究已经进入分子水平。
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