摘要
真菌感染尤其是深部真菌感染的频率和严重性急剧的增加，寻找治疗深部真菌感染的药物十分迫切。细胞壁是低等真核生物所特有而哺乳动物中不存在的细胞组分，对真菌的存活至关重要。β-1，3-葡聚糖(β-1,3-glucan)是细胞壁中含量最多并且最重要的成分，无论它们在数量或质量上发生变化都会对真菌细胞产生致命的影响。β-1,3-葡聚糖合成酶(β-1,3-glucansynthase)存在于细胞膜中，催化β-1,3-葡聚糖的合成，是真菌细胞壁合成的最重要的酶之一。抑制β-1,3-葡聚糖合成酶，将抑制真菌的生长繁殖。因此葡聚糖合成酶是理想的抗真菌药物的作用靶点，以此为靶点的药物可以避免细胞毒性，并且与多烯类和唑类等抗真菌药物不产生交叉耐药。 本研究从白色念珠菌ATCC10231培养液中提取了葡聚糖合成酶蛋白，确立了葡聚糖合成酶活性的测定方法，初步建立了以β-1,3-葡聚糖合成酶为靶点的抗真菌药物筛选模型，并且用此模型对本所的3200个微生物发酵液样品进行了筛选，从细胞水平筛选可以抑制白色念珠菌的微生物发酵液样品，得到抑制率大于80％的阳性样品112个，筛选阳性率为3.5％。运用所建立的β-1,3-葡聚糖合成酶抑制剂筛选模型对那112个发酵液样品进行筛选，得到抑制率大于80％的阳性微生物发酵液样品6个，筛选阳性率为5.3％。 β-1，3-葡萄糖聚合体是白色念珠菌细胞壁中最重要的组成部分，在维持细胞的机械强度和正常的渗透压上起着非常重要的作用。β-1，3-葡聚糖合成酶是葡聚糖合成途径中的关键酶，催化UDP-葡萄糖聚合成β-1，3-葡聚糖。研究表明：β-1，3-葡聚糖合成酶是由催化亚基和调节亚基两个亚基组成。催化亚基是大的膜整合蛋白分子，具有16次跨膜结构，小的GTP结合蛋白CaRho是葡聚糖合成酶的调节亚基。二者共同决定着酶的生物学功能。任何一个亚基单独存在时都没有催化活性，只有把两种成分聚合时才可以发挥葡聚糖合成酶的活性。本研究应用分子生物学的方法，克隆表达β-1，3-葡萄糖合成酶的调节亚基，为建立以调节亚基为靶点的抗真菌药物筛选模型奠定基础。 我们以白色念珠菌ATCC10231提取的DNA为模板，应用PCR方法得到CaRho基因编码的DNA片断，克隆至pGEM-T载体，构建了pT-CaRho，对pT-CaRho测序结果表明PCR产物的DNA序列与文献报道的完全相同。再将此片段克隆至巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达载体PPIC9k中，构建重组表达质粒PPIC9K-CaRho。SalI线性化重组表达质粒，电转化线性的PPIC9K-CaRho片段至毕赤酵母宿主菌GS115中。重组菌株以1％终浓度甲醇诱导表达，SDS-PAGE对表达产物的分析表明：表达产物出现了分子量为20kD的蛋白条带，实现了β-1，3-葡聚糖合成酶调节亚基的高效表达，为建立以CaRho蛋白为靶点的抗真菌药物筛选模型奠定了坚实的基础。
NETL