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摘要
肝纤维化不论何种病因，细胞外基质(exacellularmatrix，ECM)增加是其特征，表现为ECM数量增加和/或成分改变。其发展的细胞和分子机制的阐明，为这一疾病的防治提供了依据。几乎所有的临床和动物实验研究均提示纤维化的发生发展与氧化应激(oxidativestress，OS)、氧自由基损伤、脂质过氧化等有关。研究证实，抗氧化剂可通过抑制肝星状细胞(hepaticstellatecell，HSC)活化和增殖，减少ECM的合成，从而起到预防和减轻肝纤维化的作用。 现代研究发现，银杏叶所含主要成分银杏黄酮甙能有效地清除体内有毒过氧自由基的作用，银杏苦内酯因其有高度专属性抗血小板活化因子(PAE)的作用而引起国际医学界的关注。近年来，欧洲专题报道银杏叶中存在活性成分Bioparyl(一种抗氧化剂)，可调节核糖核酸酶的活性，防止/逆转各组织纤维变性，因此推测银杏叶有抗氧化应激作用，可促进肝纤维化的恢复。 迄今为止对银杏叶提取物抗肝纤维化的作用及其机制缺乏系统深入的研究，国内外尚无银杏叶提取物治疗实验性肝纤维化的研究报道。为此，我们进行实验研究，利用四氯化碳诱导大鼠肝纤维化模型，采用银杏叶提取物对其进行治疗，观察银杏叶提取物对肝纤维化大鼠一般情况及肝功能指标、肝脏组织病理学的影响；对肝组织中氧化指标MDA的含量，SOD、GSH-PX的活性的影响；对肝纤维化大鼠细胞因子TGF-β1和ActivinA表达的影响；对肝纤维化大鼠肝星状细胞活化及肝细胞凋亡的影响；以及对肝纤维化大鼠肝组织MMP-1及TIMP-1基因表达的影响。希望通过本组实验研究银杏叶提取物对大鼠肝纤维化的治疗作用，并从分子水平、细胞水平以及氧化应激、细胞外基质降解方面探讨银杏叶提取物治疗大鼠肝纤维化的作用机制，为临床合理应用银杏叶制剂提供参考依据。整个实验共分为6个部分： 1银杏叶提取物对肝纤维化大鼠一般情况及肝功能指标的影响目的：利用银杏叶提取物对肝纤维化大鼠进行治疗，观察治疗过程中肝纤维化大鼠的一般情况及其血清肝功能指标的变化。 方法：48只雄性SD大鼠被随机分为四组：正常组、肝纤维化模型组、秋水仙碱组和治疗组。除正常组外，其余三组用50％的CCL4腹腔注射造模。8周后，处死正常组和模型组大鼠，分离血清行肝功能生化指标检测。剩余大鼠治疗组每天给予银杏叶提取物灌胃，秋水仙碱组则给予秋水仙碱灌胃治疗。治疗8周后，处死这两组动物，标本采集和检验方法同前。在整个实验过程中，观察各组大鼠精神、食欲、毛发等一般情况。 结果：模型组大鼠精神萎靡，活动减少，毛色暗淡，厌食，大便稀溏；治疗组大鼠精神好转，食欲提高，毛色变亮，大便逐渐成形。模型组大鼠体重较正常组明显减轻，治疗组体重增加，与模型组比较差异显著，但与秋水仙碱组比较没有统计学意义。模型组大鼠肝重和脾重均较正常组增加，治疗组大鼠肝重和脾重则明显减轻，与模型组和秋水仙碱组比较均有显著性差异。血清肝功能生化指标方面，模型组大鼠较正常组ALT、AST、AKP明显升高，ALb明显降低(P＜0.01)；治疗组各项指标较模型组明显改善(P＜0.01)，与秋水仙碱组比较差异也有显著性意义(P＜0.01)。 结论：银杏叶提取物能明显改善肝纤维化大鼠精神、食欲、毛色、体重等一般情况，减轻肝纤维化大鼠肝重和脾重，显著改善肝纤维化大鼠肝功能各项生化指标。 2银杏叶提取物对肝纤维化大鼠肝脏组织病理学影响目的：应用银杏叶提取物对肝纤维化大鼠进行治疗，观察各组大鼠肝脏组织病理学变化，研究银杏叶提取物对肝纤维化大鼠的治疗作用。 方法：采用苏木素-伊红(HE)法对各组大鼠肝组织切片染色，光镜下观察并进行肝纤维化病理分级。应用胶原纤维三色染色(Masson)法和网状纤维染色法对各组大鼠肝组织切片分别进行染色，采用计算机图像分析系统进行分析，计算出各组大鼠肝组织胶原纤维和网状纤维含量并进行对比。 结果：HE染色显示肝纤维化分级，治疗组较模型组明显减轻(P＜0.01)，与秋水仙碱组也有显著性差异(P＜0.05)。Masson染色显示胶原纤维含量，模型组为11.4±1.2％，治疗组为4.6±0.9％，秋水仙碱组为9.1±1.0％，治疗组与模型组、秋水仙碱组均有显著性差异(P＜0.01)。网状纤维染色显示网状纤维含量，模型组为12.4±0.9％，治疗组为4.0±1.1％，秋水仙碱组为10.4±0.9％，治疗组与模型组、秋水仙碱组差异均有显著性意义(P＜0.01)。 结论：银杏叶提取物能明显减轻大鼠的肝纤维化程度，对四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化有良好的治疗作用。 3银杏叶提取物对肝纤维化大鼠肝脏氧化指标的影响目的：研究银杏叶提取物对肝纤维化大鼠肝脏氧化指标的影响，从氧化应激方面探讨银杏叶提取物治疗大鼠肝纤维化的作用机制。 方法：应用组织匀浆的方法对各组大鼠肝组织氧化指标MDA、SOD及GSH-Px进行检测，测定其含量并进行比较。 结果：与正常组比较，模型组SOD、GSH-Px活性明显降低，MDA含量显著上升；与模型组比较，秋水仙碱组SOD活性升高，GSH-Px活性、MDA含量无明显改变；治疗组SOD、GSH-Px活性显著升高，MDA含量显著下降，较模型组和秋水仙碱组均有显著性差异(P＜0.01)。 结论：银杏叶提取物能显著降低肝纤维化大鼠肝组织中MDA的含量，提高SOD、GSH-Px的活性，具有较强的抗氧化作用。 4银杏叶提取物对肝纤维化大鼠TGF-β1和ActivinA表达的影响目的：研究银杏叶提取物对肝纤维化大鼠细胞因子TGF-β1和ActivinA表达的影响，从分子水平探讨银杏叶提取物治疗大鼠肝纤维化的作用机制。 方法：应用免疫组织化学方法对大鼠肝组织中TGF-β1和ActivinA的蛋白表达进行检测，采用计算机图像分析系统进行分析，计算出各组大鼠肝组织阳性染色面积百分比并进行比较。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对各组大鼠肝组织中TGF-β1和ActivinA的mRNA含量进行测定，利用计算机图像分析系统算出各自的光密度值，与内参三磷酸甘油醛(GAPDH)的mRNA积分光密度值相比后在各组之间进行比较。 结果：正常大鼠肝组织中几乎不表达TGF-β1和ActivinA蛋白，模型组两者阳性染色面积百分比分别为17.1±1.0％和11.4±1.2％，治疗组分别为5.6±0.7％和4.1±0.5％，秋水仙碱组分别为12.1±1.0％和9.4±0.9％，治疗组与模型组、秋水仙碱组比较均有显著性差异(P＜0.01)。RT-PCR方法显示正常肝组织几乎不表达TGF-β1及ActivinAmRNA，而模型组为强表达，治疗组较模型组表达减弱，秋水仙碱组介于两者之间，治疗组与模型组、秋水仙碱组比较差异均有显著性意义(P＜0.01或P＜0.05)。 结论：银杏叶提取物能显著降低肝纤维化大鼠肝组织中TGF-β1和ActivinA表达，TGF-β1和ActivinA表达减少可能是银杏叶提取物治疗大鼠肝纤维化的分子机制之一。 5银杏叶提取物对肝纤维化大鼠肝星状细胞活化及肝细胞凋亡的影响目的：研究银杏叶提取物对肝纤维化大鼠肝星状细胞活化及肝细胞凋亡的影响，从细胞水平探讨银杏叶提取物治疗大鼠肝纤维化的作用机制。 方法：应用免疫组织化学方法检测大鼠肝组织中α-SMA蛋白的表达，采用计算机图像分析系统进行分析，计算出各组大鼠肝组织阳性染色面积百分比并进行比较。采用原位末端标记(TUNEL)法检测大鼠肝组织中肝细胞凋亡情况，计算出凋亡指数(AI)，在各组之间进行对比。 结论：银杏叶提取物能显著减弱肝纤维化大鼠肝星状细胞活化，减少肝细胞凋亡；肝星状细胞活化减弱、细胞凋亡减少可能是银杏叶提取物治疗大鼠肝纤维化的细胞学基础。 6银杏叶提取物对肝纤维化大鼠肝组织MMP-1及TIMP-1基因表达的影响目的：研究银杏叶提取物对肝纤维化大鼠肝组织MMP-1及TIMP-1基因表达的影响，进一步从细胞外基质降解方面探讨银杏叶提取物治疗大鼠肝纤维化的作用机制。 方法：应用采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对各组大鼠肝组织中MMP-1及TIMP-1基因的mRNA含量进行测定，利用计算机图像分析系统算出各自的光密度值，与内参三磷酸甘油醛(GAPDH)的mRNA积分光密度值相比后，在各组之间进行比较。 结论：银杏叶提取物能明显升高肝纤维化大鼠肝组织中MMP-1基因表达并下调TIMP-1基因表达，通过降低TIMPs表达水平，解除对MMPs的抑制，从而增强细胞外基质的降解可能是银杏叶提取物治疗大鼠肝纤维化的作用机制之一。 总之，本研究表明银杏叶提取物能明显改善肝功能，使肝组织纤维化程度减轻，有显著治疗肝纤维化的作用。通过银杏叶提取物治疗，显著降低了纤维化肝组织中MDA的含量，提高了SOD、GSH-Px的活性，说明银杏叶提取物有较强的抗氧化作用。与肝纤维化模型组相比，银杏叶提取物治疗组TGF-β1和ActivinA表达水平显著降低，HSC活化减弱，肝细胞凋亡减少，MMP-1基因表达升高，TIMP-1基因表达下降，与SOD、GSH-Px的活性负向变化，与MDA及肝纤维化的程度同向变化。因此，通过抗氧化应激而抑制HSC的活化，降低TGF-β1和ActivinA表达水平，减少肝细胞凋亡，下调TIMP-1基因表达并上调MMP-1基因表达可能是银杏叶提取物治疗肝纤维化的重要作用机制。
关键词
银杏叶提取物/肝纤维化/氧化应激/转化生长因子β1/肝星状细胞/肝细胞凋亡/基质金属蛋白酶/临床疗效引用本文复制引用
授予学位
博士学科专业
中医内科学导师
涂晋文学位年度
2006学位授予单位
湖北中医药大学语种
中文中图分类号
R5