摘要
变态反应疾病被世界卫生组织列为二十一世纪重点防治的三大类疾病之一，是当前世界性的重大卫生学问题。作为变态反应疾病之一的支气管哮喘是临床常见病、多发病，迄今仍缺乏有效的防治措施。屋尘螨是常见过敏原，哮喘、过敏性皮炎与过敏性鼻炎患者都对尘螨过敏，85％的哮喘患者屋尘螨特异性IgE抗体为阳性。核酸疫苗具有容易生产、稳定强、较为安全等优点，同时可以诱导细胞与体液应答的能力。因此核酸疫苗具有一定的应用前景，在防治变态反应疾病中也有重要价值，本研究就是要构建防治变态反应疾病的过敏原基因疫苗。 本研究将编码屋尘螨主要变应原Derp2的基因克隆到pcDNA3.1中，构建屋尘螨Ⅱ类变应原Derp2基因疫苗(pDerp2)。通过RT-PCR和免疫组织化学观察其在体外培养的人胚肾上皮细胞的mRNA和蛋白表达；通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测pDerp2在小鼠骨骼肌的Derp2基因mRNA表达；并将Balb/c小鼠分组，用pDerp2及重组蛋白对小鼠进行了免疫，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清中IgE、IgG1与IgG2a抗体变化，来观察pDerp2的免疫原性。结果成功构建了编码屋尘螨Derp2变应原的基因疫苗，并通过PCR与BamHI/EcoRI双酶切鉴定；并能在人胚肾上皮细胞与小鼠骨骼肌表达；研究发现用pDerp2免疫BALB/c小鼠能明显诱导免疫应答，产生较高的IgG2a抗体，但并不诱导机体产生IgE抗体。 同时用重组屋尘螨Derp2变应原(rDerp2)建立小鼠变态反应气道炎症动物模型，将Balb/c小鼠随机分为Saline组、pcDNA组、基因疫苗组和PBS组。在基因疫苗免疫小鼠后，BALB/c小鼠被致敏，再用重组Derp2变应原经鼻激发；通过HE染色(haematoxylinandeosin)和PAS染色(PeriodicAcid-Schiff)观察小鼠肺部炎症和粘液分泌；观察支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数和细胞分类；用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BALF中白细胞介素4(IL-4)、γ干扰素(IFN-γ)和IgE和IgG2a抗体的变化，以研究屋尘螨Derp2基因疫苗对重组Derp2变应原诱导的变态反应性气道炎症的免疫保护作用。结果显示肺组织发生病理变化，编码屋尘螨Derp2变应原的基因疫苗能有效抑制变应原诱导的炎症细胞侵润和粘液分泌；结果还发现基因疫苗免疫明显抑制小鼠BALF中炎症细胞的浸润，降低BAL液中IL-4浓度，并有效增加IFN-γ的浓度，能抑制小鼠血清中抗原特异性IgE、IgG1产生。 此外，本研究还观察了屋尘螨Derp2基因疫苗对信号转导蛋白和转录激活因子6(STAT6)的影响，探讨基因疫苗在过敏性哮喘抗原特异性免疫治疗中的作用机制。用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BALF中白细胞介素13(IL-13)水平；免疫组织化学方法检测肺部信号转导蛋白和转录激活因子6(STAT6)的分布；免疫印迹法检测肺组织STAT6的表达；凝胶阻滞电泳检测(EMSA)STAT6的激活能力。结果表明编码屋尘螨Derp2变应原的基因疫苗能明显降低BAL液中IL-13浓度；肺组织STAT6的表达与组织分布被明显减弱，STAT6在肺部的活化被有效地抑制。 本研究成果是成功构建了屋尘螨Derp2基因疫苗，并发现用pDNA疫苗免疫BALB/c小鼠能明显诱导IgG2a抗体免疫产生，而不诱导机体产生IgE抗体产生，而且发现基因疫苗通过诱导以Th1为主的免疫应答，从而产生对重组Derp2变应原诱导变态反应性气道炎症的免疫保护作用。同时还发现基因疫苗对重组Derp2变应原诱导的变态反应性气道炎症的免疫保护作用很有可能是通过伴随下调STAT6的表达与活化来实现的，为探讨变态反应疾病发病的机制、为核酸疫苗对防治变态反应疾病的机理提供一定的理论基础。
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