摘要
β-葡聚糖酶是重要的工业用酶，可有效消除谷物β-葡聚糖在酿造和饲料工业中产生的负面影响。与国外相比，我国对β-葡聚糖酶的研究起步较晚，且研制的β-葡聚糖酶的热稳定性普遍较差，不能满足现代啤酒糖化工艺和颗粒饲料造粒的温度要求，因此提高β-葡聚糖酶的热稳定性具有非常重要的意义。本课题以大肠杆菌表达系统克隆和重组表达了β-葡聚糖酶基因；建立了高通量筛选耐热β-葡聚糖酶的方法；以克隆的β-葡聚糖酶基因为起始材料，通过设计的定向进化策略和建立的筛选手段提高野生型β-葡聚糖酶的热稳定性；检验所构建的热稳定性重组菌株的遗传稳定性；对热稳定性突变株EGs2的发酵条件进行优化；筛选并优化出提高β-葡聚糖酶热稳定性的复合保护剂；估算了热稳定性β-葡聚糖酶的储藏寿命。主要研究结果如下：从BacillussubtilisZJF-1A5中克隆了大小为849bp的β-葡聚糖酶基因。通过序列比对，该基因编码的氨基酸序列与BorrissR、Sun，J和Hidetoshi发表的β-葡聚糖酶的氨基酸序列分别有1-3氨基酸的替换。β-葡聚糖酶基因经BamHI和HindⅢ双酶切后与用同样限制性内切酶切割的载体pET28a(+)进行重组表达，得到了27KD的有活性的β-葡聚糖酶。对酶在宿主细胞中的位置进行测定，结果显示：β-葡聚糖酶不仅分泌至细胞外，而且也存在于细胞内和周质空间。发酵上清液经硫酸氨盐析沉淀和DEAECellulose52离子交换柱层析，纯化的β-葡聚糖酶经SDS-PAGE电泳鉴定，纯化产品为单一条带，分子量约27KD。纯化的β-葡聚糖酶的热学性质研究表明：β-葡聚糖酶的Tm值为62.5℃，最适反应温度为55℃。 本研究将定位膜转印和肉眼可见的平板筛选策略相结合，通过对影响菌落生长、酶的表达和转印成功率的各因素的优化，建立了高通量筛选耐高温β-葡聚糖酶的方法。结果显示：每个LB平板(直径90mm)用4μl200mg/mlIPTG；IPTG要预先涂在LB平板上；菌落密度约为100个/平板；菌落培养时间为37℃，15小时；完全钝化野生型酶的条件为100℃2小时。对该方法的稳定性考察结果显示：该方法的重现性为100％，假阳性率为0.16％，假阴性率为12.22％。与其它高通量筛选方法相比，以滤膜为基础的高通量筛选方法存在许多优点，如透明圈清晰，假阳性率较低，筛选通量高，操作简便，费用低等。该方法作为一种固相酶筛选方法，在鉴别热稳定性和低温下催化活性同时得到提高的变异体时非常有效。 为了提高β-葡聚糖酶的热稳定性，利用体外定向进化技术对编码β-葡聚糖酶的基因进行改造。设计的定向进化策略包括一轮的随机突变和一轮的DNA改组。应用建立的高通量筛选方法筛选热稳定性突变体，最终获得EGs1和EGs2两株热稳定性突变体。通过对野生酶和突变酶的DNA序列和酶学性质分析发现：EGs1和EGs2分别有四个和五个氨基酸替换；这些氨基酸替换使EGs1和EGs2突变酶的Tm值分别比野生酶的Tm值(62.5℃)提高了3℃和5℃，达到了65.5℃和67.5℃；突变酶的最适反应温度也提高了5℃；两个突变酶对地衣多糖的水解能力分别被提高28％和降低21.6％；对地衣多糖的亲和力与野生型的一致，未见改变；在酶的最适pH值上，野生酶和EGs1突变酶为6.5，而EGs2突变酶为7.0；在酶的pH值稳定性方面，野生型和突变型β-葡聚糖酶都有较宽的pH稳定范围，在pH6.0-8.5的范围内放置48h，β-葡聚糖酶仍保持80％以上的酶活力。这一结果说明了定向进化在提高酶的热稳定性方面是比较有效的。 遗传稳定性检验结果表明：EGs1和EGs2突变株传代50次后，质粒稳定性良好，重组表达的目的产物活性保持恒定，说明突变株的遗传稳定性良好。 通过摇瓶发酵分析，突变株EGs2最佳生长条件为：装液量40ml，接种量1.5％，初始pH值为6.5-7.0。在此条件下，菌体生长6小时后进入稳定期。分别用IPTG和乳糖作为诱导剂，对适于菌体生长和目的产物表达的条件进行优化，结果显示：IPTG和乳糖都可以作为重组工程菌的诱导剂；乳糖的诱导效果稍好于IPTG的诱导效果；IPTG浓度对菌体生物量和目的产物表达量影响不大，而乳糖浓度对菌体生物量和目的产物表达量的影响较大。温度对目的产物在上清液中的积累影响较大，对菌体生物量的影响不大。合适的IPTG诱导条件为：诱导时间，4小时；诱导剂浓度，0.1mmol/L；诱导温度，34℃。合适的乳糖诱导条件为：诱导时间，4小时；诱导剂浓度，10mmol/L；诱导温度，32℃。 通过单因素实验，筛选出能提高β-葡聚糖酶热稳定性的保护剂，并设计正交实验优化复合保护剂组成。结果表明白蛋白，明胶和CaCl2.2H2O都能明显提高β-葡聚糖酶的稳定性；复合保护剂配方为：0.8％(w/v)白蛋白，2％(w/v)明胶，1mmol/LCaCl2.2H2O。含保护剂的β-葡聚糖酶的Tm值比不含保护剂的酶的Tm值高4℃，加保护剂和未加保护剂的酶液在36.2℃下的热降解速度分别为-0.0398和-0.084，这说明保护剂对酶的热稳定性和储存稳定性都起到了较好的保护作用。 利用加速实验估算了β-葡聚糖酶在不同温度下的储存寿命。选择的实验温度为28℃，36.2℃，45℃。将盛有β-葡聚糖酶的样品瓶放入不同温度的水浴中，不同时间取样并测定β-葡聚糖酶活性。实验数据的统计处理结果得出：β-葡聚糖酶在45℃，36.2℃和28℃活性损失10％所需时间为1.36d，4.37d和20.09d。活性损失50％所需时间为8.5d，25.47d，104.9d。由寿命估算曲线估算出β-葡聚糖酶在25℃,20℃，15℃，4℃和0℃时，活性损失10％需要的时间分别为30.7d，67.0d，145.9d，2.21年，4.14年；活性损失50％所需时间为154.0d，316.0d，648d，3154d。从加速实验的结果可以看出β-葡聚糖酶的稳定性可以满足储存的需要。加速实验可以在较短时间内估算出β-葡聚糖酶的储存寿命。
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