目的肾综合症出血热(Hemorrhagicfeverwithrenalsyndrome，HFRS)是一种由汉坦病毒引起的急性病毒性传染病，起病急、症状重、病死率高，且目前尚无有效的治疗手段。因此，做好汉坦病毒的预防工作具有重要的现实意义。近年来，随着分子生物学的迅速发展，核酸疫苗作为一种新生物技术的出现为我们防治HFRS提供了新的思路，其相对于传统疫苗具有无可比拟的优势，代表者未来疫苗的发展方向。目前，已有研究者成功构建了若干亚型的汉坦病毒核酸疫苗，但研究重点更多的集中在核酸疫苗的免疫效果上，对于其在机体内的动力学研究相对较少。因此，本实验构建了含有汉坦病毒76-118株编码核蛋白(Neucleoprotein，NP)S抗原基因片段的核酸疫苗，研究其在体外真核细胞中的表达，肌肉接种后在小鼠体内组织分布及持续表达时间，进而探讨汉坦病毒核酸疫苗的应用前景。 本实验以此为目的，进行了以下研究：(1)以质粒pEGFP-C1为载体，质粒pTargeT/S中含有的S抗原基因片段为目的基因，构建GFP-NP融合蛋白真核表达重组质粒pEGFP/S；(2)脂质体体外转染Vero-E6细胞，观察重组质粒pEGFP/S在真核细胞中的表达；(3)免疫接种小鼠胫前肌，观察pEGFP/S在小鼠体内的组织分布及持续表达时间。 方法一、汉坦病毒S基因真核表达重组体的构建使用限制性内切酶EcoRⅠ、Sa1Ⅰ消化质粒pTargeT/S，纯化得到S基因片断，克隆至同样经EcoRⅠ、Sa1Ⅰ消化的质粒pEGFP-C1上相应位点，酶切鉴定，得到重组质粒pEGFP/S。使用超纯质粒中提试剂盒提取质粒，-20℃保存。 二、脂质体体外瞬时转染真核细胞人工复苏培养Vero-E6细胞，使其在细胞培养瓶中覆盖率达到80％，胰酶消化后以每孔8×104-2.0×105个细胞的密度接种已铺有盖玻片(经盐酸酒精浸泡)的10个孔(12孔细胞培养板)中，12小时细胞爬片后以脂质体介导重组质粒pEGFP/S(超纯质粒中提试剂盒提取)转染Vero-E6细胞，48小时后按间接免疫荧光法，固定封闭后分别滴加鼠抗NP单克隆抗体、罗丹明标记山羊抗鼠二抗及DAPI染液，封片后荧光正置显微镜观察。 三、免疫用质粒pEGFP/S的扩增、纯化参照《分子克隆指南(第3版)》，首先将已转入pEGFP/S的大肠杆菌DH5α，于30mlLB培养基培养中16～18小时，取25ml培养物于500mlLB培养基培养2.5h，加2.5ml氯霉素溶液(34mg/ml溶于乙醇)，再继续培养12～16h。碱裂解法大量提取培养物中质粒后，聚乙二醇法纯化质粒DNA，测量OD260/280，计算质粒DNA浓度，储存于-20℃。 四、小鼠的免疫接种6～8周龄雌性BALB/c小鼠30只，随机分为3组，实验组对照组各14只，一组注射pEGFP/S质粒，另一组注射PBS，另取2只作空白对照组。先在实验组对照组小鼠双侧胫前肌分别注射0.75％利多卡因50μl预处理，次日于相同部位注射质粒pEGFP/S100μg/只(实验组)，或PBS100μl/只(对照组)。 五、表达产物的检测接种后3d、7d、15d、30d、60d，随机将实验组、对照组各2只小鼠分别分离肝、脾、肾、肺、脑及局部肌肉组织，95％酒精中固定过夜后，由恒冷冰冻切片机制成7μm厚连续冰冻切片，铺于多聚赖氨酸处理载玻片，封片后立即荧光显微镜观察。 结果一、重组质粒pEGFP/S的鉴定pEGFP/S阳性重组质粒经EcoRⅠ、SalⅠ双酶切消化后，可切出大小为1.3及4.7kb的2个片段，与预期结果相吻合。 二、荧光显微镜观察瞬时转染结果脂质体转染Vero-E6细胞48h后，荧光显微镜下观察，在紫外激发下所有细胞的细胞核均发出蓝色荧光，其中转染成功的细胞在蓝光激发下可以观察到载玻片上细胞发出绿色荧光；在绿光激发下可以观察到红色荧光；以PBS液代替一抗、二抗的对照组细胞只能在蓝光激发下观察到绿色荧光，其它对照组则未见荧光。 三、重组质粒pEGFP/S在小鼠体内组织分布及持续表达时间免疫后3d在实验组小鼠肝、肺、肾、脾、脑、肌肉各组织均检测到较强的绿色荧光，以后7d、15d、30d、60d各时间点处死的实验组小鼠在肝、脑、肺、肾、脾均检测到绿色荧光，肌肉组织15d时仍可检测到荧光，30d时荧光消失，且随着时间的延长，所有组织中表达荧光的细胞数量及荧光强度逐渐减弱，对照组未见任何荧光。 讨论一、S基因、GFP基因对汉坦病毒核酸疫苗pEGFP/S的意义核蛋白(NP)是汉坦病毒最主要的结构蛋白，有较强的免疫原性，可同时诱导机体产生体液免疫及细胞免疫，质粒pEGFP-C1是一种可以在哺乳动物细胞中高效表达的真核表达载体，其含有的绿色荧光蛋白基因(GFP)在一定波长的光线下可以激发出绿色荧光、且无需外源物质参与，对细胞无毒性，携带GFP的融合蛋白既有绿色荧光又可保持靶蛋白的生理功能，在活细胞中可以直接观察外源基因的表达。本实验利用GFP这个生理特性构建了重组质粒pEGFP/S，使我们可以更直观的观察汉坦病毒核酸疫苗在机体的分布及表达。 二、GFP-NP融合蛋白表达的意义我们在荧光显微镜同一视野蓝光和绿光激发下分别观察到了GFP及NP的表达，从而间接证明了GFP-NP融合蛋白可以在真核细胞中获得表达，为我们在后续实验的动物免疫提供了科学依据。 三、肌肉免疫对pEGFP/S表达的意义肌肉注射核酸疫苗具有接种容量大、注射安全、简便易行等优点，本研究中使用0.75％利多卡因诱导后肌肉免疫pEGFP/S，在小鼠体内取得了较好的免疫效果，证明了使用再生诱导剂诱导后肌肉注射对于pEGFP/S是一种较好的免疫方式。 四、pEGFP/S在机体内的分布表达的意义pEGFP/S免疫后可以在机体各组织内持续表达较长时间，这为机体免疫系统接受长期的抗原刺激创造了条件，可以使机体长期维持特异性的免疫力，从而证明了pEGFP/S是一种较理想的核酸疫苗。 五、pEGFP/S在脑组织中的表达质粒DNA在脑组织中的表达缺乏功能强大的树突状细胞参与抗原递呈，同时机体内血-脑屏障的存在也会极大的影响质粒DNA在脑组织的代谢。但在本研究中pEGFP/S在脑组织表达的持续时间与其它组织并无明显差异，提示机体内的一些天然生理结构对pEGFP/S在脑组织持续表达的影响并不显著。 结论1.质粒pEGFP-C1是我们研究汉坦病毒核酸疫苗一种较理想的载体。 2.pEGFP/S编码的GFP-NP融合蛋白可以在体外真核细胞中获得表达。 3.使用再生诱导剂诱导后肌肉注射对于pEGFP/S是一种较好的免疫方式。 4.肌肉免疫后pEGFP/S可以在机体内广泛分布，持续表达较长时间。 5.机体内的一些天然生理屏障不能完全阻断pEGFP/S在脑组织的表达。
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