摘要
在高血糖的条件下，许多生物大分子会发生非酶糖基化反应，产生糖基化终产物(AdvancedGlycationEndProducts，AGEs)，大量蓄积于体内并沉积于血管壁。近年大量研究证明，糖基化终产物在糖尿病性动脉粥样硬化的发病中起重要作用。基质金属蛋白酶参与动脉粥样硬化病变的进展，尤其是与斑块破裂导致的临床事件有密切关系。然而，糖基化终产物与基质金属蛋白酶的相关研究较少。 本实验旨在通过观察糖基化终产物作用后的巨噬细胞的形态变化并测定MMP-9活性、表达改变，来研究糖基化终末产物对巨噬细胞活化及其与斑块破裂的关系；并根据他汀类药物的可阻断类异戊二烯途径的特性，结合类异戊二烯中间产物的逆转效应的观察，用以确证类异戊二烯通路是否参与了AGE对巨噬细胞基质金属蛋白酶的诱导过程。 方法:体外培养小鼠腹腔巨噬细胞，分别以不同浓度BSA-AGE(0、50、100、200、400mg/L)作用48h；以相同浓度BSA-AGE(400mg/L)作用不同时间(0、12、24、36、48h)；在BSA-AGE(400mg/L)培养条件下，不同浓度的辛伐他汀(5μmoL/L，50μmol/L)作用48h；以及BSA-AGE(400mg/L)与辛伐他汀(50μmol/L)培养条件下，GGPP(10μmol/L)作用48h。提取培养液上清，采用明胶酶谱法测定MMP-9活性；通过Westernblot法检测MMP-9表达。图像光密度扫描后，统计学分析。 结果不同浓度BSA-AGE作用后，巨噬细胞MMP-9活性/表达增强，呈剂量依赖效应；BSA-AGE作用不同时间时，巨噬细胞MMP-9活性/表达增强，呈时间依赖效应；辛伐他汀可明显降低MMP-9活性/表达；GGPP可明显逆转辛伐他汀的作用，使一度被抑制的MMP-9活性/表达得以恢复。 讨论慢性高血糖可导致机体内蛋白质非酶糖基化，形成AGEs。一方面，加速交联蛋白不断沉积于血管基底膜上，形成糖尿病特征性血管病变；另一方面，AGEs与细胞表面的AGEs受体结合，释放各种细胞因子，导致糖尿病性大血管病变的进展。糖尿病患者血浆糖基化终产物浓度多在100mg/L-400mg/L之间，本实验所采用的糖基化终产物浓度分别为50mg/L、100mg/L、200mg/L及400mg/L，基本符合人体的病理条件。 基质金属蛋白酶能够分解细胞外基质，在动脉粥样硬化发展过程中起着十分重要的作用。研究发现，在动脉粥样硬化斑块破裂处MMP-9表达明显增加，是加速动脉粥样硬化病变发展的重要因素之一。同时有报道表明，糖基化终产物多分布于动脉粥样硬化斑块好发处。本研究结果显示，糖基化终产物可在体外促进巨噬细胞活化，增强巨噬细胞的基质金属蛋白酶9活性与表达，呈剂量及时间依赖效应。本研究从体外实验的角度证实了糖基化终产物刺激基质金属蛋白酶9分泌，参与了糖尿病性动脉粥样硬化的病变进展。 以往的研究文献提示糖基化终产物信号转导通路与小G蛋白密切相关。小G蛋白在胞浆中为无活性形式，经脂酰化后锚定到细胞膜表面才发挥其生物学效应。而小G蛋白的脂酰化离不开类异戊二烯中间产物。本实验表明，类异戊二烯途径抑制剂辛伐他汀可以明显降低BSA-AGE诱导的巨噬细胞MMP-9分泌/活性，类异戊二烯中间产物可逆转辛伐他汀的抑制效应，提示糖基化终产物对巨噬细胞基质金属蛋白酶的诱导效应与类异戊二烯通路有关。 总之，糖基化终产物在体外可促进巨噬细胞活化，增强基质金属蛋白酶9的活性，这可能是糖尿病性的病变形成与进展的机制之一，提示对糖基化终产物的干预可作为糖尿病性动脉粥样硬化新的治疗靶点。本研究结果还提示糖基化终产物诱导MMP-9表达与类异戊二烯途径有关，然而具体机制有待进一步研究。 结论1.BSA-AGE可以使体外培养的巨噬细胞MMP-9的分泌与活性增强，呈剂量与时间依赖效应。 2.根据他汀类药物的可阻断类异戊二烯途径的特性，结合类异戊二烯中间产物的逆转效应的观察，证实BSA-AGE诱导的巨噬细胞MMP-9的分泌增强与类异戊二烯途径有关。
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