摘要
野油菜黄单胞菌野油菜致病型(Xanthomonascampestrispv.campestrisXcc)是一种化能异养、单鞭毛，能产生胞外多糖的革兰氏阴性细菌。该细菌可在世界范围内引起十字花科植物的黑腐病(blackrotdisease)，造成重大经济损失。目前，对其防治还缺乏有效的方法。因此，了解该细菌致病过程当中的信号转导过程将有利于发展新型的抗病或防病策略与手段。在原核生物中，双组分信号传导系统(two-componentsignaltransductionsystem)是调控生理代谢的主要调控系统，对病原菌的致病性也有重要作用。该系统由组氨酸激酶和效应调节蛋白两部分组成。为了系统地研究Xcc的双组分信号系统，我们利用基于同源重组的单交换方法来构建双组分信号系统基因的突变体，从遗传学角度对其进行深入研究。通过生物信息学方法，根据双组分信号系统效应调节蛋白(responseregulator，RR)的保守序列(D1，D2和K-boxes)预测出了XccATCC33913的全部RR基因。本研究从中挑选rr01-rr10共10个基因，根据基因内部序列设计引物，PCR扩增基因片断。回收的基因片断与不能在Xcc中复制的pKnockout-Ω或pK18mob自杀质粒载体相连，重组质粒经测序验证后电转化XccATCC33913。质粒上的基因片断与细菌染色体上的相应基因发生一次同源交换，产生被质粒序列打断的两个不完整基因拷贝，从而获得基因插入突变体。每个基因随机挑选6个克隆通过Southernblotting实验验证，结果表明以上10个基因都不是细菌的必须基因，均可被本研究所采用的突变方法失活。这些突变体被用于植物抗病、渗透性、温敏性等表型筛选实验，为从生物化学和生理学角度分析这些信号转导基因的功能提供遗传学研究基础。 在以前的Xcc致病比较与功能基因组学研究工作中，通过EZ::TN＜KAN-2＞Tnp转座子诱变Xcc8004获得一个插入位点在XC3814CDS(proteincodingsequence)内的突变体。该基因在Xcc8004的基因组研究中被认为具有脂多糖核心合成的相关功能，蛋白结构中包含一个糖基转移酶功能域。Southernblotting证明转座子为单拷贝插入。为了进一步探索该基因与致病性的关系，本研究对该突变体进行致病性检测、过量表达和互补分析、细菌多糖分析等研究。实验表明与Xcc8004相比，突变体致病性明显下降，在NYGB琼脂平板上生长时，菌落形态变小而且干燥，其胞外多糖的产量仅为Xcc8004的26％，而过量表达和互补菌株均能使以上表型恢复到Xcc8004的水平，这些结果表明XC3814基因的功能可能是通过影响胞外多糖的合成，最终影响该细菌的致病过程。在寄主植物体上的生长与繁殖实验表明该突变体和Xcc8004相差不大，推测XC3814基因有可能是在致病早期的侵染过程中起作用。XccATCC33913中也存在与XC3814基因完全相同的CDS，同源序列比对推测其编码脂多糖核心多糖糖基转移酶，但通过SDS-PAGE及银染分析脂多糖的结构与含量，未发现突变体与Xcc8004的之间存在明显的差异。因此，该基因是否影响LPS的合成尚需开展进一步的实验来进行验证。
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