鼠李糖乳杆菌的筛选、鉴定及加工特性研究

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中文摘要：益生菌在促进人体健康和防止疾病发生中发挥着重要的作用。本论文从大量分离获得的乳酸菌菌株中，筛选具有优良特性的益生菌，并对其进行鉴定，为研究和开发具有自主知识产权的益生菌产品奠定基础。本论文从三个方面开展研究：即乳酸菌功能特性研究，以筛选获得性能良好的益生菌；对筛选获得的益生菌进行鉴定；益生菌加工特性研究。对分离的乳酸菌进行耐酸和耐胆汁酸盐试验，供试的15个菌株都能在pH3、0.3％胆汁酸盐中存活；供试菌株中有10个能在pH2、0.3％胆汁酸盐中存活5h，其中Q菌的生长情况最好，其耐受能力最强；在pH3、0.2％胆汁酸盐下只有Q菌能继续生长。对分离的乳酸菌进行了抑制致病性大肠杆菌和幽门螺旋杆菌的试验，通过研究供试菌株对大肠杆菌均有抑制作用，抑制作用最强的为Q菌，抑菌圈直径12.6mm，超过对照菌株BB-12的8mm。供试菌株大部分对幽门螺旋杆菌有抑制作用，抑制作用最强的为B菌，抑菌圈直径13mm，其次为Q菌12.7mm，对照菌株BB-12为9.8mm。对分离的乳酸菌进行了体外粘附能力试验，通过研究，供试菌株中对Caco-2细胞粘附能力最高的为A菌，其粘附平均值为18.7±5.92个/细胞，其次为Q菌12.9±2.74个/细胞，对照菌株BB-12为10.7±2.46个/细胞。先用乳酸菌粘附2h后，Q菌和E菌对大肠杆菌竞争粘附抑制力最强；先用大肠杆菌粘附2h，再用乳酸菌粘附，粘附数与空白大肠杆菌粘附数相差不大。对分离的乳酸菌进行了抗氧化试验，通过研究Q菌受试品喂服小鼠8天使得SOD活力增强，MDA含量有所降低，具有一定的抗氧化能力。在功能特性研究的基础上，对筛选获得的Q菌，进行初步鉴定。经传统的形态学观察及代谢产物气相色谱测定分析，Q菌归属于乳杆菌属(Lactobacillus)。通过API50CHL试验条生理生化特性研究，鉴定Q菌99.9％为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.1531，中国专利申请号为：200510111588.9，菌株名为鼠李糖乳杆菌LVl08。在此基础上，进一步利用分子生物学方法对鼠李糖乳杆菌LVl08进行了16SrRNA基因的扩增与测序，BLAST在线比对结果是：与菌株LactobacillusrhamnosusMCRF-412和LactobacillusrhamnosusMCRF-27116SrRNA的基因序列只相差一个碱基，同源性高达99.9％。与全球最著名的益生菌LactobacillusrhamnosusGGATCC53103的16SrRNA只相差2个碱基，同源性高达99.9％。再将序列与乳杆菌标准菌株的16SrRNA基因序列作同源性分析，利用Clustalw软件建立系统发育树。结果表明，鼠李糖乳杆菌LV108与标准菌株LactobacillusrhamnosusATCC7469的同源性为99.4％。结合系统发育树及16SrRNA的部分序列分析结果，可将鼠李糖乳杆菌LV108判定为1株鼠李糖乳杆菌，这与生理生化等传统分类鉴定方法所得结果完全一致。为了筛选特异性的分子标记，并在菌株水平上对鼠李糖乳杆菌更好地鉴定，首先对鼠李糖乳杆菌RAPD扩增体系进行了优化，得出RAPD扩增体系：采用模板100ng，25mMMg2+3.5μL，Taq酶1U，200μMdNTPs，10pmo1随机引物，反应总体积为25μL。PCR扩增参数：94℃2min，1次循环；94℃1min，36℃1min，72℃2min，40次循环；72℃10min结束。通过对20条随机引物的筛选，本文筛选到了1条在菌株水平具有鉴别意义的随机引物P4，序列为5'-CTGCGCTGGA-3'，并得到了可区分鼠李糖乳杆菌LV108与其他鼠李糖乳杆菌的DNA分子标记，位于大约1500bp。本文还对鼠李糖乳杆菌LV108的加工特性进行了初步的研究。通过研究显示：鼠李糖乳杆菌LV108在37℃培养27h活菌数量达到最高，最高达到8×109cfu/mL；鼠李糖乳杆菌LV108具有良好的贮藏特性，在4℃甚至25℃贮藏过程中，活菌数量均未降低，反有少量升高；在冷冻干燥下，用脱脂乳培养的鼠李糖乳杆菌LV108存活率达到56.7％，而BB-12仅为44.8％，喷雾干燥下乳酸菌的存活率仅达到0.70％左右，冷冻干燥效果明显好于喷雾干燥。研究表明鼠李糖乳杆菌LV108具有较好的加工稳定性。

作者：

薛银刚

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关键词：

益生菌鼠李糖乳杆菌 16S rRNA 系统发育树乳酸菌功能

授予学位：

硕士

学科专业：

生物化学与分子生物学

导师：

顾瑞霞

学位年度：

2006

学位授予单位：

扬州大学

语种：

中文

中图分类号：

Q93