摘要
棘胸蛙是一种主要分布在我国南方各省山区的大型经济蛙类。具有极高的食用和经济价值，对其进行蛋白质组学的研究意义重大。 [目的]采用蛋白质组研究技术，通过双向电泳分离、比较棘胸蛙蝌蚪与幼蛙肌肉组织的蛋白质表达差异，通过质谱检测分析的差异蛋白质点。寻找与鉴定棘胸蛙蝌蚪变态发育为幼蛙时期的肌肉组织存在的蛋白质差异表达，这些存在的差异蛋白质可能与棘胸蛙变态发育有着密切的关系，在动物发育生物学研究领域内具有较高的学术价值。 [方法]本研究是建立在蛋白质双向电泳(2-DE)技术和优化各类实验技术的基础上，采用2-DE联合串联质谱(MS-MS)的技术路线进行了棘胸蛙蝌蚪与幼蛙肌肉组织的蛋白质组学初步研究。一步法和标本混合法提取棘胸蛙蝌蚪与幼蛙肌肉组织的总蛋白质；以Bradford测定法绘制蛋白定量标准曲线，对肌肉组织样品蛋白提取物定量；肌肉组织蛋白质提取物以相同加样量进行双向凝胶电泳；一向等电聚焦，使用固相pH梯度凝胶条(IPGstritpH3-10NL)，胶内重泡胀技术，聚焦总电压时80kVh-85kVh；用DTT(二硫苏糖醇)和碘乙酰胺两步平衡；二向电泳采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(13％、1.5mm均一胶)；根据上样量不同分别进行银染和考马斯亮蓝染色；用ImageScanner光密度扫描仪(AmershamPharmacia公司产品)获取染色后的2-DE凝胶图谱；将2-DE凝胶图谱输入计算机，通过PDQuest软件分析找到合适的差异蛋白质点；ABI4700TOF-TOF质谱仪鉴定与分析所找出的差异蛋白质点，得到差异蛋白质的肽质量指纹(PMF)和肽序列标签(PST)；用Matrixscience公司的Mascot软件搜索NCBInr数据库，对得到的PMF和PST与数据库进行蛋白同源查询，获取差异蛋白质的信息。结合双向凝胶电泳相应表观等电点、分子量、匹配肽段和覆盖率等进行综合分析。 [结果]通过一步法和标本混合法提取棘胸蛙蝌蚪和幼蛙肌肉组织的蛋白定量结果分别是11.4084μg/μl、10.9956μg/μl。PDQuest软件分析双向电泳图谱结果，两个图谱对比共有差异点42±5个。对其中10个蛋白质点进行质谱分析，通过对NCBInr数据库检索，再通过表观等电点、分子量、匹配肽段和覆盖率等分析得到6个不同的蛋白信息：P1为troponinT3，P2、P3、P6、P7、为fasttroponinT，P4为Aldh-Aprotein，P5为creatinekinase(EC2.7.3.2)-Africanclawedfrog(fragment),P8为Enigma-provprotein,P9、P10为Ckm-provprotein。 [结论](1)建立了良好的棘胸蛙肌肉蛋白提取法，提高了分离效果，对蛋白质斑点的鉴别可提供更多的信息。(2)应用固定pH梯度(IPG)胶条可提高双向电泳的分辨率和重复性。(3)对比棘胸蛙蝌蚪与幼蛙肌肉组织的蛋白质的双向电泳图象分析结果，表明在棘胸蛙蝌蚪的发育到幼蛙过程中肌肉有显著的蛋白表达差异。(4)通过生物质谱鉴定的6种表达差异蛋白可能与棘胸蛙变态发育有关，其在棘胸蛙变态发育中的功能有待于进一步验证。
NETL