摘要
背景：本研究拟从人和大鼠红细胞中分离纯化AR，探讨AGS-Ⅳ和BDL对AR活性的影响；同时，运用BDL和EPS对离体AR的药效学，结合BDL和EPS人和大鼠的整体药动学，运用自行创建的的CAPP软件，增建以机制为基础的PK-PD结合模型，改善剂量设计，达到安全有效用药。 目的：1研究黄芪甲苷(AGS-Ⅳ)防治大鼠糖尿病周围神经病变(DPN)的药效，探讨AGS-Ⅳ对DPN的作用靶点。 2研究苄达赖氨酸(BDL)防治大鼠DPN的药效，探讨BDL的作用机理。 3探讨AGS-Ⅳ和BDL对分离纯化AR的抑制作用及其抑制机理。 4建立HPLC-MS法测定大鼠血中AGS-Ⅳ的浓度，改进用单只大鼠完成按所设时间点取血，研究AGS-Ⅳ的绝对生物利用度。 5研究黄芪总苷(AS)中AGS-Ⅳ的药动学，并与单体AGS-Ⅳ的药动学作比较。 6尝试制剂改革，研究AGS-Ⅳ包合体，以及黄芪总苷(AS)包合体和滴丸的药动学，并与AGS-Ⅳ水剂，AGS-Ⅳ的CMC剂和AS的CMC剂的生物利用度作比较。 7拟在CAPP软件包的基础上，创建以机制为基础的PD-PK结合模型。 8结合苄达赖氨酸(BDL)和阳性药依帕司他(EPS)的药动学和离体的药效学，尝试建立以机制为基础的PK-PD结合模型以确定合理的给药量和设计给药方案。 方法：1用雄性SD大鼠给予一次性腹腔注射streptozotocin(STZ)75mg.kg-1，72h后血糖≥13.9mmol/L入选糖尿病模型。 2糖尿病大鼠分别给予AGS-Ⅳ低，中，高剂量(3，6和12mg.kg-1)治疗；BDL低，中，高剂量(50，100和200mg.kg-1)治疗，用阳性药EPS(50mg.kg-1)和正常大鼠，糖尿病成模大鼠对照，饲养环境为SPF级，疗程为12周。 3恒速加温法测定大鼠甩尾温度；八道生理记录仪PowerLab测定坐骨神经传导速度；葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖；亲和层析法测定HbA1C；放免法测定血浆胰岛素浓度、尿液PGE2和TXB2；荧光分光光度法测定神经组织和血清AGEs含量；DL-甘油醛-NADPH-荧光分光光度法测定神经组织和红细胞AR活性；紫外分光光度法测定Na+-K+-ATP酶和GSH-Px活性；光镜和电镜分别观察大鼠腓肠神经的形态学改变，LeicaQwin图象分析系统对神经纤维定量分析。 4取大鼠或人红细胞经溶血，透析，离子交换柱DEAE-纤维素(DE-52)纯化，浓缩。以DL-甘油醛为底物，NADPH为辅酶，紫外分光光度法测定AGS-Ⅳ和BDL对AR的抑制活性，制作Dixon图，用Michaelis-menton动力学软件估算酶动力学常数(Ki和IC50)和抑制类型，用CAPP软件模拟效应室模型。 5用LC-ESI-MS法研究测定黄芪甲苷(AGS-Ⅳ)和黄芪总苷(AS)的血药浓度，Waters固相萃取小柱提取血浆样品，研究黄芪甲苷(AGS-Ⅳ)和黄芪总苷(AS)的药动学以及生物利用度。用CAPP软件拟合及非房室模型统计距法计算药动学参数以及二者的生物利用度。 6在CAPP软件包的基础上，根据离体试验和血药浓度两者应有相应关系的基本原理创建以机制为基础的PD-PK结合模型。 7将已有的BDL和EPS健康志愿者和大鼠的药动学数据，以及上述用离体试验所得的的药效学数据，应用所得PD,PK参数模拟效应的E-T曲线和中央室的C-T曲线，以此探讨药物的给药方案。 结果：1AGS-Ⅳ和BDL显示出对大鼠DPN的防治作用，且药效呈剂量依赖性。AGS-Ⅳ和BDL均能改善糖尿病的“三多一少”等症状，降低DPN大鼠的甩尾温度，提高坐骨神经传导速度，改善生化指标包括：降低血糖和HbA1C；增加血浆胰岛素水平；降低神经组织和血清AGEs水平；抑制神经组织和红细胞AR活性；提高神经细胞膜和红细胞膜Na+-K+-ATPase活性；提高神经组织GSH-Px活性；并改善DPN的有髓神经纤维脱髓鞘以及神经外膜糖化蛋白的沉积等病理形态学改变。 2大鼠和人的红细胞溶血液经DEAE-52层析柱分段收集后，经紫外光谱分析证明得到了纯化的AR。AGS-Ⅳ和BDL对纯化的AR均有抑制作用，AGS-Ⅳ对大鼠红细胞AR的抑制为反竞争性抑制，抑制常数Ki和IC50分别为9.28和1.38μmol/L；BDL对人红细胞AR的抑制为非竞争性抑制，抑制常数Ki和IC50分别为57.22和24μmol/L。 3大鼠静注AGS-Ⅳ溶液2mg.kg-1血药浓度的经时曲线证实为二室模型，其药动学参数t1/2β(hr)，CL(L/hr)，Vd(L/kg)，AUC0-∞(ng.h/ml)分别为：3.46±0.52，0.47±0.02，0.76±0.16和4274±186。AGS-Ⅳ-A和AGS-Ⅳ-C，以及AGS-Ⅳ-Ⅰ低中高(5，10和20mg.kg-1)三种剂量的药-时曲线除AGS-Ⅳ-A为二室模型外，其余均符合一室模型，药动学参数如下：t1/2(hr)分别为4.05±0.54，8.29±0.58，8.26±0.84，9.57±0.96和10.92±1.41，MRT(hr)分别为5.03±0.66，14.11±2.30，12.21±1.92，15.60±1.97和17.35±2.26，Cmax(ng/ml)分别为433.3±81.89，64.88±9.55，126.43±28.38，256.49±26.33和293.68±22.22，Tmax(hr)分别为0.92±0.30，6.67±1.63，1.13±0.31，1.58±0.38和1.67±0.41，AUC0→∞(ng.hr/ml)分别为1321.94±130.41，863.15±123.31，1062.32±63.36，2175.45±229.68和4895.88±214.72；绝对生物利用度分别为3.1，4.0，9.9，10.2和11.4。 4AS-C，AS-D和AS-Ⅰ中高两个剂量的药-时曲线符合一室模型，药动学参数如下：t1/2(hr)分别为8.73±1.20，5.38±0.57，6.20±0.61和9.94±2.23，MRT(hr)分别为12.76±1.67，8.26±1.11，9.20±1.14和13.82±3.59，Cmax(ng/ml)分别为338.03±90.97，393.02±30.50，291.57±49.77和336.48±41.46，Tmax(hr)分别为2.96±1.74，1.29±0.33，0.83±0.13和1.13±0.41，AUC0→∞(ng.hr/ml)分别为1937.46±316.87，1980.33±280.92，1330.08±167.00和3211.65±222.45；绝对生物利用度分别为4.5，4.6，6.2和7.5。 5人的BDL和EPS的药动学符合一室模型，BDL的Ka(h-1)，Ke(h-1)和Vd/F(L)分别为0.187,4.377和5.66，EPS的Ka(h-1)，Ke(h-1)和Vd/F(L)分别为1.53,0.73和3.7。大鼠BDL的药动学也符合一室模型，Ka(h-1)，Ke(h-1)和Vd/F(L/kg)分别为1.17，0.15和2.17。 6人的BDL，EPS和大鼠BDL的药-效曲线均符合Sigmoid-Emax模型。人BDL的Emax(％)，IC50(μmol/L)和陡度系数(s)值分别为90.2％，24和1.99,人EPS的Emax(％)，IC50(μmol/L)和s值分别为96.1％，2.39和2.13；大鼠BDL的Emax(％)，IC50(μmol/L)和s值分别为92.6，24.13和1.93。 结论：1AGS-Ⅳ和BDL通过多靶点途径，能够防治STZ诱导的糖尿病大鼠周围神经病变，具有潜在的治疗价值。 2建立了DE-52柱层析法从红细胞中分离出AR。AGS-Ⅳ对AR的抑制为反竞争性抑制，BDL对AR的抑制为非竞争性抑制。 3与AGS-Ⅳ水溶液，CMC混悬液和AS的CMC混悬液比较，包合体技术能够显著提高AGS-Ⅳ和AS的生物利用度。 4与AS的CMC混悬液比较比较，AS-滴丸的T1/2a缩短，表明AS-滴丸在提高吸收方面优于AS的CMC混悬液。 5与AGS-Ⅳ的水剂比较，AGS-IVCMC混悬液吸收减慢，AUC增加。与AGS-Ⅳ的CMC混悬液比较，AS的CMC混悬液的吸收增快，AUC增加表明AS的CMC混悬液中的AGS-Ⅳ较单一成分的AGS-Ⅳ易吸收，生物利用度提高。 6在CAPP软件包的基础上，离体药效学模型和整体药动学模型，建立了以机制为基础的PD-PK结合模型，并证实它可用于预测BDL和EPS在整体上的的量-效关系，可用于设计合理的给药方案和剂型改革等问题。
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