摘要
本课题着重探讨在细胞增殖、分化和凋亡过程中JWA基因表达的规律和特点，特别是与蛋白激酶C(PKC)激活的MAPK信号通路的关系。旨在初步揭示JWA基因参与调节细胞增殖、分化和凋亡信号通路的分子机制，从而为阐明肿瘤发生和发展的分子机制(特别是与环境因素相关的)，进而对肿瘤的化学预防提供新的科学依据。 一、JWA作为PKC下游分子参与调节TPA诱导的K562细胞分化TPA是公认的PKC激动剂。已知TPA诱导K562分化涉及多个信号转导通路，但确切的分子机制还未被阐明。为进一步研究和探讨JWA参与TPA诱导的K562细胞分化的分子机制，我们成功建立了TPA诱导K562细胞向单核-巨噬细胞样分化实验模型，以及TPA诱导瞬时转染过表达JWA(JWA-K562)和低表达JWA(asJWA-K562)的K562细胞模型。研究结果显示，随着TPA诱导的K562细胞单核-巨噬细胞样分化，JWA蛋白表达明显增加。100ng/mlTPA可显著抑制未转染的K562细胞的增殖(第3、5天)，并诱导分化。与之比较，TPA处理的asJWA-K562细胞的增殖未受明显抑制，然而TPA处理JWA-K562细胞的增殖同样受到明显抑制。采用PKC抑制剂H-7(终浓度20μmol/L)预处理K562细胞24h后，再用200ng/mlTPA诱导K562细胞48h。Westernblot结果显示，JWA蛋白表达受到明显抑制。此外，将10μmol/LJWA反义寡核苷酸(antisenseJWAoligonucleotides，ajos)、20μmol/LH-7与K562细胞分别或共同孵育24h，以阻断JWA表达PKPKC表达，再以200ng/mlTPA处理48h。流式细胞仪对细胞表面抗原分析显示，下调JWA蛋白表达水平能部分抑制TPA诱导的K562细胞分化；当同时用ajos和H-7处理时，则TPA诱导K562细胞分化的能力基本被完全阻断(细胞表面抗原CD¨b的表达下降65％，CD33上升34％)，对TPA诱导K562细胞分化的抑制作用呈现相加的效应。进一步证实JWA蛋白的表达为TPA诱导K562细胞向单核-巨噬细胞样分化所必须；TPA诱导K562细胞分化不仅依赖PKC，而且也依赖JWA的表达；TPA对JWA表达的调节作用既有直接作用，也可通过PKC的介导。 二、JWA通过PKC-α介导参与TPA诱导的细胞分化PKC家族成员多，分布广。各亚型有着不同的酶学特性，在细胞信号传递中的作用也有着显著差异。PKC-α就是其中最重要，最典型的PKC亚型和信号分子之一。为进一步探讨TPA是如何通过PKC调节JWA基因的，是否也同样通过PKC-α激活JWA基因。我们瞬时转染PKC-α反义寡核苷酸(antisense-PKC-α)，分别导入K562和HeLa细胞。转染细胞12h后，再分别用TPA(50ng/ml)和ATRA(1μmol/L)处理48h。实验结果显示，TPA不再刺激JWA蛋白表达的增加。这表明TPA可通过激活PKC-α调节JWA基因。推测PKC-α直接磷酸化了JWA编码蛋白中的丝氨酸残基(Ser)，从而激活JWA参与细胞分化的调控。但是PKC-α究竟是如何磷酸化JWA的磷酸化位点的，还有待于进一步研究。此外，鉴于ATRA处理瞬时转染antisense-PKC-α的HeLa细胞，JWA蛋白表达没有明显变化，表明ATRA诱导JWA蛋白表达增加是通过其它的信号分子。 三、JWA参与调节ATRA抑制HeLa细胞增殖和诱导凋亡众所周知，ATRA可抑制多种肿瘤细胞的增殖，诱导细胞分化和凋亡。JWA基因是受ATRA诱导的新的细胞骨架样基因，与细胞的分化和凋亡相关。因此，为进一步深入研究JWA基因参与ATRA抑制细胞增殖、诱导分化和凋亡的可能的分子机制，我们成功构建了稳定转染过表达JWA和低表达JWA的HeLa细胞株，并在此基础上建立了ATRA处理上述HeLa细胞模型。 实验结果显示，以不同浓度的ATRA(0.05、0.1、0.5、1.0、5、10μmol/L)处理HeLa细胞不同时间(1、3、6、12、24和48h)，JWA蛋白表达均上调，并存在着时间-反应和剂量-反应关系；ATRA同时也增强JWA的启动子转录活性。MTT、Hoechst和流式细胞仪结果显示：ATRA引起的细胞增殖抑制和促凋亡现象与JWA蛋白表达上调密切相关。提示JWA对于ATRA引起的细胞增殖抑制和促凋亡进程可能是至关重要的。 为进一步探讨ATRA如何刺激JWA表达的。我们构建了JWA部分启动子(-1680bp/+107bp)的不同长短片断的报告基因。采用CAT-ELISA检测ATRA处理HeLa细胞对JWA基因启动子转录活性的影响。结果发现，ATRA(5μmol/L)处理48h，JWA基因-194bp/+107bp启动子片断相对CAT酶活性显著增加，与对照比较增加约7倍，并且也显著高于ATRA处理的其它JWA启动子DNA片断CAT酶活性(p＜0.001)。进一步用Southwestern实验检测到了未经ATRA处理组JWA基因序列-194bp/-68bp片断DNA探针与某种核蛋白(分子量约为33.5kDa)存在的特异结合；在ATRA(5μmol/L，48h)处理后却消失了。提示在JWA基因启动子序列-194bp/-68bpDNA片断中可能存在某顺式作用元件(cis-actingelement)。ATRA可能通过去除与JWA启动子结合的阻遏因子而调节JWA基因的表达，从而进一步激活受JWA调节的下游信号分子的作用，最终调节靶细胞的分化或凋亡。 由于JWA基因启动子-194bp/+107bp序列中存在两个CCAAT顺式作用元件，而-194bp/-68bpDNA片断只包含其中近5’端的第一个CCAAT顺式结合元件，都是CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBPs)的结合位点，同时C/EBPs的亚型C/EBPε的分子量也约为33.5kDa。因此，可以认为存在于细胞内的该阻遏蛋白在基础状态下，几乎只与JWA启动子中近5’端第一个CCAAT结合。我们推测该未知核蛋白可能是C/EBPs的一个亚型，可以与JWA启动子-194/+107bp片断中近5’端的第一个CCAAT特异性结合或解离。ATRA可能是通过激活C/EBPs与JWA基因启动子中近5’端的第一个CCAAT特异性解离DNA结合蛋白，调控JWA转录活性，从而介导JWA参与调控ATRA引起的细胞增殖抑制和促凋亡进程。但是直接的证据还有待于进一步证实。 四、JWA调节ERK的磷酸化激活c-Raf-MEK-ERK信号转导通路是诸多信号途径中与细胞增殖、分化密切相关的最重要的信号通路之一。目前研究较多的是ERK1/2。ERK1/2蛋白水平的活化是TPA和ATRA作用细胞后的必然事件，涉及细胞增殖抑制、分化和凋亡。为了探讨JWA基因参与调控TPA诱导K562细胞分化是否涉及ERK，我们采用脂质体法瞬时转染ajos(10μmol/L)，导入K562细胞。转染12h后，用TPA(100ng/m1)分别处理0.5、1、24h。Westernblot结果显示，ERK1/2总蛋白水平在药物作用后无明显变化。瞬时转染ajos明显下调TPA诱导的JWA蛋白的表达水平；同时，磷酸化ERK1/2蛋白(p-ERK1/2)表达水平也明显下降。这表明下调JWA表达可抑制ERK的磷酸化修饰。 为了进一步证实JWA对ERK的磷酸化的调节作用。我们构建了稳定转染过表达JWA的细胞株(JWA-HeLa)和低表达JWA的细胞株(asJWA-HeLa)，并以不同浓度的TPA(5、10、20、50ng/ml)和以不同浓度的ATRA(0.05、0.1、0.5、1、5、10μmol/L)分别处理上述细胞48h。结果同样显示，下调JWA表达可抑制ATRA诱导的ERK磷酸化。另一方面，采用MEK抑制剂PD98059抑制了ERK磷酸化，但并不影响JWA蛋白表达水平。 因此，我们推测JWA参与TPA诱导K562细胞分化，以及ATRA抑制HeLa细胞细胞增殖和诱导凋亡过程，均通过影响ERK的磷酸化而最终实现的。JWA蛋白表达对MAPK级联反应中ERK的磷酸化激活是至关重要的。ATRA诱导ERK磷酸化可能依赖于JWA的表达，JWA可能是ATRA激活的MAPK信号转导通路中新的信号调节分子。 五、JWA通过调节ERK磷酸化影响冷休克诱导HeLa细胞凋亡ERK介导的生物学效应十分广泛，作为细胞应答环境刺激的主要信号分子之一，同样涉及细胞的多种理化应激的刺激。而JWA本身是活跃的环境应答基因，似乎作为ERK的上游分子对其有调节作用。与热休克反应相比，有关生物体对低温适应的研究，还不是特别深入。文献报道冷休克诱导细胞凋亡涉及ERK信号通路。为此，我们设计用冷休克细胞模型探讨JWA是否对ERK分子及其相应的作用有调控作用。 我们建立了HeLa细胞冷休克处理模型：分别将HeLa、asJWA-HeLa置于4℃冷休克处理0.5-4h，然后恢复37℃18h；同样，PD98059预处理24h后，再使HeLa细胞冷休克。实验结果显示，随着冷休克导致HeLa细胞发生凋亡，JWA蛋白表达显著增加；与对照组比较，抑制JWA蛋白表达进而抑制ERK磷酸化，细胞凋亡率均显著增加(P＜0.05，P＜0.01)。提示JWA和ERK参与冷休克诱导细胞凋亡的信号通路。结合前面的研究，我们认为JWA参与冷休克诱导细胞凋亡的机制可能同样是通过调节ERK磷酸化而实现的。
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