摘要
轮状病毒(Rotavirus，RV)是呼肠孤病毒科轮状病毒属的成员，是世界范围内引起婴幼儿及多种幼龄动物急性病毒性腹泻的主要病原体之一。其感染广泛，发病率也相当高，5岁以下的婴幼儿90％以上都感染过轮状病毒。目前还没有治疗轮状病毒腹泻的特效药物。接种疫苗来预防轮状病毒感染显得尤为重要。另外流行病学的研究表明自然感染RV后，可以使人和动物产生自然免疫力。随着分子生物学技术的高速发展和植物细胞培养及再生方法的完善，有研究表明，将细菌性和病毒性病原体抗原的编码基因导入植物细胞，能够表达出较好保留天然免疫原性的抗原，因此科学研究者们尝试将转基因植物转变为人类所需昂贵药品的廉价的“生产工厂”。 随着研究的深入，现已明确了轮状病毒的基因结构。其病毒粒子由三层衣壳组成，其中外壳由VP7和VP4两个蛋白组成。VP7是一种糖蛋白，是构成外壳蛋白的主要成分。它不仅是病毒的中和蛋白而且能诱导机体产生特异性中和抗体，因此对其进行克隆和分析在疫苗的研制中具有重要的意义。基于此基础之上本实验将轮状病毒主要抗原基因VP7转化于烟草之中，从而为进一步生产轮状病毒植物疫苗奠定基础。 本实验进行了以下三个方面的研究：(1)植物表达载体的构建：以pBI121载体为背景，根据已克隆的Vp7基因序列设计了一对引物，经PCR扩增、BamHⅠ和SmaⅠ双酶切后与pBI121载体连接，构建成植物高效表达载体pBI121-Vp7，通过卡那霉素筛选获得阳性克隆，测序比较后通过冻融法转入根癌农杆菌LBA4404中备侵染用。 (2)转基因烟草的研究：通过农杆菌介导的叶盘法将Vp7基因转化入烟草NC89中。经过卡那霉素抗性筛选最终获得了转基因烟草50株。通过提取转基因烟草的DNA、RNA分别进行PCR、RT-PCR检测；然后提取植株的总蛋白，通过SDS-PAGE电泳结果显示转基因烟草表达了重组抗原蛋白，随后进行了Western杂交检测，结果表明转基因烟草表达的重组抗原具有反应原性。 (3)苜蓿的遗传转化：利用农杆菌介导的叶盘法，选取子叶和下胚轴为外植体，采用SH和改良SH基本培养基，现已获得大量的抗性愈伤组织，并且在愈伤组织上有绿色的突起(似分化状)，尚未得到分化完全的再生植株。
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