紫花苜蓿高频再生体系的建立及农杆菌介导的木霉几丁质酶基因转化的研究

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中文摘要：本文利用农杆菌介导法，将木霉几丁质酶基因转入紫花苜蓿秘鲁中，提高其抗菌性。本文探讨了三种品种紫花苜蓿(陇东苜蓿、阿尔冈金、秘鲁)的组织培养程序，确定出再生能力最强的品种及外植体。通过植物表达载体(PBI121+CHI)的构建，利用农杆菌介导法转化木霉几丁质酶(CHI)基因，建立了一套农杆菌介导苜蓿基因转化的优化体系。主要研究结果如下：1、组织培养再生能力的建立试验表明：MS+2,4-D(2.0mg/L)+6-BA(0.5mg/L)+蔗糖0.3％+琼脂0.08％；MS+KT(0.5mg/L)+NAA(0.01mg/L)+蔗糖0.3％+琼脂0.08％；1/2MS+NAA(0.01mg/L+蔗糖0.15％+琼脂0.08％分别是紫花苜蓿的愈伤组织、芽、根的适宜诱导培养基。下胚轴的愈伤组织诱导率相对高于子叶节，并且不同品种间秘鲁远远高于阿尔冈金和陇东苜蓿，通过三个不同品种的六组重复试验数据表明，在A3培养基上下胚轴愈伤组织诱导率比子叶节的高，但分化效果却相对低。由此可见，不同激素浓度配比的培养基再生体系的建立影响不同。在4种分化培养基中B1培养基植株再生分化频率最高可达96％，B4分化频率最低，下胚轴：B4＜B1＜B2＜B3(52％＜58％＜64％＜74％)；子叶节：B4＜B3＜B2＜B1(56％＜60％＜82％＜96％)。在相同生长素浓度、不同细胞分裂素浓度的分化培养基中，B1培养基分化频率相对高于其它培养基，即：B1＞B2＞B3＞B4。试验结果表明，愈伤组织分化频率不是由激素配比值决定的，而是由不同浓度激素之间协同作用的结果。本试验中B1为最佳分化培养基，紫花苜蓿秘鲁子叶节分化频率最高。 2、植物表达载体的构建将目的基因(CHI，序列长度1275bp左右)克隆到植物双元表达载体PBI121(14758bp)上，即：CHI基因取代GUS基因插入到质粒PBI121上，构建成表达载体PBI121+CHI，通过冻融法转化到根癌农杆菌中，得到植物表达载体。 3、CHI基因转化体系的建立以农杆菌为载体，对紫花苜蓿秘鲁的子叶节进行了转化。通过试验证明，预培养时间、AS浓度、供试菌株的生理活性、和6-BA浓度均影响转化率，子叶节外植体预培养2天可以显著提高转化效率，在共培养时加入AS40μmol/L可以提高转化率3.1％用pH5.6的YEB活化供试菌株，转化效果较好，6-BA浓度为0.5mg/L时有利于转化。获得愈伤组织最高转化率为54％。最后诱导分化获得完整的转化植株。PCR检测表明，转基因紫花苜蓿秘鲁植株已整合了CHI基因。

作者：

钱瑾

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关键词：

紫花苜蓿再生体系农杆菌介导木霉几丁质酶基因转化植物抗菌性

授予学位：

硕士

学科专业：

草业科学

导师：

刘发央、谢小冬

学位年度：

2006

学位授予单位：

甘肃农业大学

语种：

中文

中图分类号：