紫花苜蓿是一种优质豆科牧草，有“牧草之王”的美称。近年来，随着对紫花苜蓿需求量的增加，紫花苜蓿产业化进程加快，苜蓿在酸性土壤上种植的呼声也愈高。在我国，紫花苜蓿主要种植在北方中性和碱性土壤上。随着西部大开发和退耕还林还草工作的进一步深入，产业结构的调整，紫花苜蓿的种植范围不断扩大，南方苜蓿种植已经成为苜蓿产业化的重要方面。然而，我国南方酸性土壤分布广、面积大，耐酸苜蓿根瘤菌资源缺乏。为此，筛选耐酸苜蓿根瘤菌十分必要。 国外在中度酸性土壤上种植紫花苜蓿的经验表明，酸性土壤上接种高效耐酸苜蓿根瘤菌是提高紫花苜蓿产量和品质的重要措施。借鉴国外经验，本研究从我国西南地区土壤分布类型和苜蓿种植情况入手，对紫花苜蓿耐酸根瘤菌进行了筛选，研究了耐酸苜蓿根瘤菌的生长特性、对紫花苜蓿生长和结瘤的影响，探讨了Ca2+作用下的耐酸机理。并通过田间试验，检测施Ca2+和接种耐酸苜蓿根瘤菌对酸性土上紫花苜蓿生长及产量和品质的影响，以期建立一套耐酸苜蓿根瘤菌筛选和鉴定体系，为在西南紫花苜蓿新种植区接种高效耐酸苜蓿根瘤菌奠定基础。研究的主要结果如下： 1.从在酸性土(pH5.2)上生长的紫花苜蓿根瘤中分离到若干苜蓿根瘤菌株，其中六株根瘤菌能够在pH4.8的固体培养基上稳定生长，分别编号为91511、91512、91521、91522、91531、91532，这六株根瘤菌均能使紫花苜蓿植株在9d左右结瘤，培养30d后，苜蓿植株平均每株结瘤数达10个以上，结瘤率也较高，约为66.67％-100％。 2.六株苜蓿根瘤菌在不同酸度(pH7.0、pH6.0、pH5.5、pH5.2、pH5.0、pH4.8)下生长曲线的测定结果表明，酸显著降低根瘤菌的生长速率，使其生长延滞期增长，对数生长期滞后，稳定期延迟。六株根瘤菌均能在pH5.0及以上的液体培养基中生长，菌株91532还能在pH4.8液体培养基中生长，说明，在低pH条件下，耐酸苜蓿根瘤菌在其耐受酸度范围内经过延长的延滞期后仍然能够较快地生长。平均代时的测定结果表明，酸性条件下各根瘤菌的平均代时均较中性条件下的长，环境pH越低，菌株平均代时越长。 3.采用正交试验法研究了两个苜蓿品种在不同环境pH(pH4.8、5.2、5.6)下接种六株苜蓿根瘤菌株的效果。结果表明，菌株、环境pH、植株品种对苜蓿整株鲜重的影响均极显著，影响程度依次为环境pH(F=71.8970)、苜蓿品种(F=27.0499)和菌株(F=11.8361)；环境pH、菌株对苜蓿有效根瘤数有极显著影响，植株品种的影响不显著，环境pH是影响苜蓿有效结瘤的最主要因素(F=8.0809)；苜蓿根瘤菌对苜蓿根瘤固氮酶活性的影响极显著(F=14.4269)，环境pH的影响显著，而植株品种的影响不显著；菌株和环境pH对苜蓿全氮含量均有极显著影响，植株品种的影响显著，以环境pH的影响最大(F=49.3877)。说明，在酸性环境中，环境pH是影响苜蓿产量和品质的主要因子，接种高效耐酸苜蓿根瘤菌、选择优良的苜蓿植株品种可以在一定程度上降低环境pH对苜蓿生长的负效应。 4.一定浓度Al(0μmol/L、20μmol/L、30μmol/L，pH4.5)处理下，用三株耐酸苜蓿根瘤菌91512、91522、91532接种转基因苜蓿株系R9、R13和R3，与不接种相比，转基因苜蓿现瘤早、结瘤量大，平均每株结瘤数多。接种耐酸苜蓿根瘤菌91512，在株系R3和R13中，有Al(30μmol/L)和无Al(0μmol/L)刺激下均可检测到有机酸的分泌。株系R3在Al30μmol/L和Al0μmol/L处理下，接种耐酸苜蓿根瘤菌，苹果酸分泌量均较高，分别高达284.2μmol·L-1·plant-1和232.3μmol·L-1·plant-1，分别比不接种的提高6.3倍和1775.3倍。株系R13分泌草酸较多，以Al0μmol/L处理下分泌量较高，接种的分泌量略高于不接种的。结果表明，在一定浓度Al处理下，接种耐酸苜蓿根瘤菌可以促进转基因苜蓿结瘤和有机酸分泌，有利于提高共生系统耐受铝毒的能力。说明，用耐酸铝的苜蓿植株接种耐酸苜蓿根瘤菌在酸铝胁迫下可以取得良好的结瘤和共生效果。 5.为检测Ca2+对紫花苜蓿及苜蓿根瘤菌耐酸的作用机理，本研究首先检测了不同酸度(pH5.5、pH5.2、pH5.0、pH4.8)下Ca2+对苜蓿根瘤菌株91512生长的影响，结果表明，加入一定浓度的Ca2+(5mmol/L、10mmol/L)能提高苜蓿根瘤菌的生长速率，使苜蓿根瘤菌提前进入对数生长期。通过检测不同酸度(pH7.0、pH6.0、pH5.5、pH5.2、pH5.0、pH4.8、pH4.5)下Ca2+对紫花苜蓿根毛变形的影响，表明中性pH条件下，Ca2+的加入对苜蓿根毛变形率无显著影响，低pH条件下，加入2mmol/L、5mmol.L和10mmol/LCa2+均可提高根毛变形率，Ca2+浓度越高，其影响越显著，说明，低pH下，Ca2+可能会促进苜蓿根瘤菌与其宿主之间的识别。通过检测低pH(pH5.5、pH5.2、pH5.0、pH4.8)下Ca2+对紫花苜蓿结瘤的影响，表明，低pH条件下，加入Ca2+可以使苜蓿结瘤提前、结瘤率提高；结瘤动力学检测结果表明，加入一定浓度的Ca2+可以使同期结瘤数增加，越是结瘤后期，环境pH越低，这种表现越明显。 6.检测了施Ca2+和接种耐酸苜蓿根瘤菌对缙云山酸性土上紫花苜蓿生长及产量和品质的影响，结果表明，接种耐酸苜蓿根瘤菌对苜蓿植株瘤重、根鲜重、株高、植株上部鲜重、全氮含量和酸性土壤中根瘤菌定殖的影响显著，对酸性土壤中全氮和和交换性钙增减量的影响不显著。施Ca2+对植株根鲜重、株高和上部鲜重的影响达到了极显著水平，对瘤重的影响显著。施用5mmol/LCa2+，苜蓿生长和结瘤的效果最好，表明在酸性土壤中，施用适当浓度的Ca2+可以提高紫花苜蓿的产量和品质。相关分析结果显示，瘤重与植株上部鲜重、根鲜重和株高成极显著相关关系，与植株全氮含量成显著相关关系，说明良好的结瘤性能能够提高酸性土壤上紫花苜蓿的产量和品质。
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