摘要
目的 了解本地区临床分离的铜绿假单胞菌对β-内酰胺类和喹诺酮类药物的耐药情况，为临床合理用药提供参考依据；对多重耐药铜绿假单胞菌进行基因分型，了解其同源性；重点研究铜绿假单胞菌产β-内酰胺酶的特性和对喹诺酮类药物的耐药机制。 方法 l、用琼脂稀释法检测β-内酰胺类和喹诺酮类药物对70株铜绿假单胞菌临床分离株的MIC，并检测泵抑制剂CCCP对MIC的影响；用Nitrocefin显色法对铜绿假单胞菌产β-内酰胺酶进行定性检测；改良三维试验检测AmpC酶和ESBLs；对多重耐药株选用ERIC2为引物，进行PCR分型，确定其同源性。 2、用特异性引物对质粒和染色体DNA进行PCR扩增，以确定产酶基因的位置及类型；IEF电泳检测细菌所产TEMβ-内酰胺酶的pI；对TEM基因进行DNA序列测定和同源性分析，并对其进行原核表达。 3、从临床铜绿假单胞菌中筛选出CIP耐药菌10珠和敏感菌10珠，分别对两组进行CIP摄取实验，并对II类拓扑异构酶gyrA和parc基因的QRDR进行PCR扩增，用限制性内切酶SacII对保守区进行酶切，并用PCR-SSCP技术筛查其基因突变，最后用序列分析明确突变基因。 结果 1、70株铜绿假单胞菌对PIP的耐药率最高为35．7％，最低为IMt的7．1％，对AMK也较低，为11．4％，对其他11种抗菌药物的耐药率在17．1％～32．9％之间。外排泵阳性株为4株；所试菌40株产β-内酰胺酶，其中6株菌高产AmpC酶，2株产ESBLs；ERIC2引物可将2C株多重耐药铜绿假单胞菌分成个7基因型。 2、仅8株铜绿假单胞菌分离出一个约7kb的质粒，PCR扩增4株TEM基因阳性，DNA序列测定分析2株产广谱酶TEM-1，另2株产TEM型ESBLs(SHV-29和SHV-147)，其中blaSHV．147与blaSHV-29基因高度同源，其所推导的氨基酸序列与blaSHV．29相比较仅有1个氨基酸残基的差异(Ala222→Val)，为一种新的质粒介导SHV型β-内酰胺酶(GenBank登录号：DQ279850)；染色体DNA的PCR结果显示6株菌ampC基因呈阳性；重组表达的TEM-147β-内酰胺酶pI约为5．4，三维试验证实为ESBL。 3、CIP敏感组与耐药组之间的CIP摄入量存在差异(p<0．05)，敏感组细菌CIP的摄入量大于耐药组；其中耐药菌Pa4-127株存在药物聚积的下降，经CCCP处理后，接近为正常水平；6株CIP耐药菌株gyrA基因83位存在ACC→ATC突变，导致氨基酸Thr→011e的改变，8株CIP耐药菌株均在gyrA基因132(CAC→CAT)位和parc基因105位(CCT→CCA)存在沉默突变。gyrA基因突变菌株对CIP表现出高水平耐药，同时对PIP、CPZ、CTX和CAZ也表现较高的耐药性，但大多数对IMP敏感。 结论 1、本地区铜绿假单胞菌产生β-内酰胺酶是其对β-内酰胺类抗生素耐药的主要机制之一；经检测有TEM型和AmpC型β-内酰胺酶，其中质粒上携带bIaTEM基因，而染色体上存在ampC基因。 2、在国内我们首次从临床分离铜绿假单胞菌中发现TEM-29和TEM-147型ESBL。 3、铜绿假单胞菌对CIP的耐药主要与GyrA蛋白的相应氨基酸突变有关，特别是突变发生在Thr83位时，能产生对环丙沙星的较高水平耐药。 4、临床上，针对gyrA基因突变菌株所致感染可以选择IMP治疗。
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