摘要
本研究以胡杨当年生枝条的带芽茎段为外植体，首先建立了它的离体快繁及植株再生体系，并就植物生长调节剂等因素对胡杨叶片再生不定芽的影响进行了详细的研究；然后利用NPTⅡ筛选基因对影响根癌农杆菌介导胡杨遗传转化的条件进行了深入探索，通过优化转化条件，建立了胡杨遗传转化系统；最后在此基础上，进行rolB-pttGA20ox双价基因的转化，并由PCR、PCR-Southern杂交分子检测，验证rolB-pttGA20ox基因的插入情况。 研究结果摘要如下： 1.胡杨组培再生体系的建立 消毒的最佳方法为：夏季采集的材料：70％的酒精浸泡30sec后，以0.1％氯化汞分别灭菌7min、8min；初春水培枝条：试剂同上，茎尖灭菌0.5min，茎段灭菌1.0min。最适宜的启动培养基为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L，MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+糖20g/L为增殖培养的最佳配方，生根培养的最适培养基为1/2MS+IBA1.0mg/L+糖25g/L+琼脂6g/L+AC0.2g/L，生根率达到811％。移栽炼苗以蛭石：珍珠岩(2∶1)或者沙子：土壤(1∶1)作为最佳基质。 2.在组培中黄化现象产生的规律以及避免的方法 在一个继代周期内，随着时间的推移，试管苗的黄化率越来越高，整体呈现线性上升的趋势；经生理生化指标研究发现，当继代时间超过20d后，叶绿素含量尤其以叶绿素a的降幅较大，建议可以接种20d为一个继代周期；ABA为IAA、ZR的拮抗物，它的消长过程大体上与生长过程是相反的；采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法对蛋白质进行分析，发现黄化试管苗电泳谱带均出现缺失等异常现象。这说明黄化苗在基因表达调控上出现差异，其内部机制可能已发生变化。 研究影响胡杨黄化率的培养条件因子发现：培养基的pH值在6.0～7.0之间、昼夜变温处理、不同波段的光质中以蓝光对降低胡杨黄化率有较好效果。 3.胡杨遗传转化体系的建立 胡杨叶片再生的最适培养基是MS+BA0.5mg/L+NAA0.1～0.2mg/L+腺嘌呤40mg/L+水解乳蛋白500mg/L+白砂糖25g/L+琼脂6.0g/L，再生频率达100％；叶片培养的最佳取材位置是自茎尖展叶始第1～3片叶；叶片正面向上或正面向下接种培养，对其形成不定芽无显著影响；由丛生芽和愈伤组织两个途径得到的无菌苗上的叶片在再生能力方面没有明显差异。对于卡那霉素和G418而言，在叶片转化以及筛选、增殖、生根阶段，它们的适宜浓度分别为15mg/L和10mg/L；对于羧苄青霉素和头孢霉素而言，叶片转化、筛选、增殖阶段的适宜浓度为200～500mg/L，而在抗性芽生根培养时的适宜浓度为200～600mg/L。头孢霉素或羧苄青霉素的抑菌效果因农杆菌菌株的不同而存在差异，羧苄青霉素对农杆菌LBA4404抑制效果好，头孢霉素对农杆菌C58及LBA4404抑制效果均较理想，适宜浓度为100～200mg/L。 4.胡杨的遗传转化与转化植株的获得 试验结果表明，预培养2d，0D600=0.5左右农杆菌菌液侵染20min，共培养3d，延迟筛选4d；共培养培养基中添加乙酰丁香酮200μmol/L而菌液中不添加的方式下，胡杨叶盘转化频率最高。 5.转化植株的分子检测 以未转化的植株为阴性对照，以质粒DNA为阳性对照，以pttGA20ox以及rolB-pttGA20ox特异引物进行PCR检测，结果表明，转基因植株扩增的条带和质粒中的目的条带一致，而未转化植株没有扩增出任何条带，进一步的PCR-Southern杂交检测表明外源基因已插入胡杨基因组中。
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