摘要
猪传染性胃肠炎(TransmissibleGastroenteritisenteritis，TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒引起的一种高度接触性肠道传染病，临床症状主要表现为发病仔猪严重腹泻、呕吐和脱水，该病给我国养猪业造成了巨大的损失。本研究从病原学上证实了该病在四川的流行，建立了TGEV基因芯片检测新方法，进行了重要功能基因的分子生物学研究，对TGE的诊断、预防和控制具有重要意义。 1猪传染性胃肠炎病毒SC-H株的分离鉴定 将腹泻病料接种到到ST细胞(猪睾丸传代细胞)上，连续盲传5代后开始出现典型的细胞病变，病变在接毒后30h开始出现，表现为：细胞肿胀、变圆、有散在堆积、最后细胞皱缩、崩解破碎，脱落。该病毒的TCID50为10-3.92/0.04ml、病毒能被猪传染性胃肠炎病毒阳性血清所中和，中和指数为242；透射电镜观察细胞中聚集大量的病毒粒子，病毒粒子呈球形，大小约75-90nm，病毒以胞外分泌的方式释放到细胞外；病毒对5溴脱氧尿核苷不敏感，为RNA病毒，对乙醚、氯仿敏感，对胰蛋白酶有抵抗力，pH4.0-pH8.0稳定。将分离鉴定的病毒命名为SC-H株。SC-H株的分离为该病的病原学研究、诊断和防制积累了材料。 2TGEVSC-H株主要基因的克隆与分析 用RT-PCR技术扩增了猪传染性胃肠炎病毒SC-H株的S(分为S1、S2、S3、S4四段)、sM、M、N、ORF7、S及POL基因，将扩增片段插入pMD18-T载体构建了重组质粒pMD-S1、pMD-S2、pMD-S3、pMD-S4、pMD-sM、pMD-M、pMD-N、pMD-ORF7、pMD-S及pMD-POL，核苷酸测序结果显示S1、S2、S3、S4长度分别为1260bp、1280bp、1062bp、1217bp，序列拼接后S基因片段长4542bp；sM、M、N，ORF7、S和POL扩增片段长度分别为378bp、852bp、1188bp、436bp、886bp及303bp。S、sM、M、N和ORF7扩增片段分别包括TGEV完整的ORF2、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7，长度分别为4344bp、249bp、789bp、1149bp和237bp，分别编码1147、82、262、382、78个氨基酸。S、sM、M、N、ORF7编码区的核苷酸序列和其他参考毒株的核苷酸序列同源性分别在98.1-99.8％、98.1-99.7％、94.2-99.7％、98.1-99.9％及93.6-99.5％之间，氨基酸同源性在94.1-99.7％、92.7-98.8％、92.0-99.2％、95.3-99.5％及84.8-96.2％之间。进化分析显示SC-H株与Purdue株有相对较近的遗传距离。TGEV主要基因的克隆与分析为后续构建检测基因芯片和研究功能基因奠定了基础。 3TGEV检测基因芯片的初步构建 从重组质粒pMD-S1、pMD-S2、pMD-S3、pMD-S4、pMD-sM、pMD-M、pMD-N、pMD-ORF7、pMD-S及pMD-POL中直接扩增了TGEV的靶基因，并采用异丙醇沉淀的方法纯化。在40℃、44℃、48℃、52℃、56℃对这些靶基因进行杂交，确定了S、S3、sM、M、N、ORF7、POL等7个基因作为TGEV检测芯片的靶基因。确定了TGE芯片的最佳反应条件及参数：在氨基化玻片上的一个阵列内，每个靶基因点1排，每排12个样点，点与点中心距为650μm，样点直径为220μm；点样环境参数为湿度55-65％，温度15-30℃，点样后室温干燥过夜；60-80℃水合处理10sec；紫外线交联30min和0.2％SDS洗涤5min，再以蒸馏水快速洗涤后离心干燥，密封保存。最佳靶基因点样浓度为200ng/μl，最佳探针浓度为3000pg/μl，Cy3-dCTP标记浓度为2.5μmol/L，预杂交时间为1h，杂交时间为6h，杂交温度为48℃。 用多重PCR技术对TGEV样品进行标记，TGEV混合探针与TGE芯片杂交效果好。TGE检测基因芯片与HCV、PPV、PRV、PRRSV、JEV、APP等疾病无交叉反应。该芯片能检测出最低含量为10ng/μl的探针。芯片的批间试验和批内重复试验结果均无显著差异，一张芯片至少可重复利用10次。用软件QuantArray(R)Ver3.0获取和分析芯片数据，确定信号中位强度值≥1000，SNR值≥1.5为TGE基因芯片检测的阳性标准。TGE检测芯片具有特异性好、灵敏度高，重复性好等优点。TGE检测芯片为TGE的诊断提供了一种特异性更高的基因检测新方法，也可用于构建多个猪病联合检测芯片。 4猪传染性胃肠炎病毒SC-H株N基因的表研究 用设计的一对引物从重组质粒pMD-N中扩增了猪传染性胃肠炎病毒N基因编码区，将其插入pMD18-T载体构建了pMD18-T-N重组质粒，用BamHⅠ和SalⅠ双酶切后将N基因亚克隆进PET-32a(+)表达载体，构建了重组表达质粒PET-32a-N并对其进行酶切鉴定和核苷酸序列测定。将PET-32a-N质粒转化BL2l(DE3)大肠杆菌进行表达，表达的最佳IPTG诱导浓度为0.8mmol/L，最佳诱导时间为3h，最大表达量可达菌体总蛋白含量的35.6％，重组N蛋白大小为47KDa。重组蛋白以包涵体和可溶蛋白两种形式存在于细胞质中，但以包涵体为主。对重组N蛋白用试剂盒进行了纯化，纯化蛋白含量为3mg/ml。western-blotting试验和蛋白斑点杂交试验证明重组N蛋白具有抗原性。表达的N蛋白可用于研究蛋白结构、制备诊断制剂以及制备亚单位疫苗等。
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