摘要
肺癌是恶性程度和发病率均较高的肿瘤之一，肿瘤的发生是多因素、多阶段、多步骤的复杂过程。分子生物学研究表明，肺癌的发生与癌基因激活、抑癌基因失活密切相关，这些基因改变的结果最终导致肿瘤细胞生长的无限制性。在细胞发生恶性转化过程中，除癌基因、抑癌基因的正负调节失控外，细胞周期调控因子也是参与癌变过程的调节位点。CyclinD1基因是近年来提出的重要原癌基因，其基因蛋白产物在细胞周期关键限速点G1-S转换中起重要正调控作用，使其成为一个有潜力的肿瘤基因治疗的理想靶点。 CyclinD1蛋白于1991年被发现并克隆出其相应的cDNA，该蛋白在细胞周期关键限速卡点G1-S期转移中通过激活cdk4和cdk6，使后者催化一系列关键底物(如Rb蛋白)磷酸化，导致转录因子释放，促进DNA合成而发挥加速细胞增殖的正性调节作用。CyclinD1是细胞增殖的正性调控因子，参与细胞的DNA合成、复制，促进细胞进入有丝分裂，它的正常表达代表细胞正常的增殖活性。CyclinD1基因的过表达，加速和维持细胞持续增殖，使细胞获得永生化，成为具有无限增殖能力的肿瘤细胞。这对于细胞的恶变和肿瘤细胞的形成具有极为重要的意义，如果能够特异性地抑制肿瘤细胞的CyclinD1活性或抑制其合成，就可以阻断肿瘤细胞的细胞周期，使其失去无限增殖能力，肿瘤停止生长，甚至自动消退而达到治疗目的。 目前反义抑制CyclinD1的合成主要通过以下几种途径：1、利用核苷类似物抑制CyclinD1合成；2、利用反义技术抑制CyclinD1活性，包括通过导入CyclinD1编码基因的反义DNA序列及mRNA序列，抑制其转录与合成；3、利用分化诱导剂抑制CyclinD1活性；4、利用拮抗剂减少CyclinD1-CDK4复合物的生成，降低其活性。而通过克隆一段特定的反以cDNA序列(长度约20bp左右，通常为上游启动序列或核心编码序列)，干扰CyclinD1蛋白合成，从而导致基因沉默治疗肺癌的方法，尚少见报道。 本研究选定人编码CyclinD1的CCND1基因核心模板区域(CDS)上游启动子序列(181-200bp)作为作用靶位，以人工合成并标记荧光蛋白的反义寡核苷酸链(ASON)抑制此靶区，用脂质体共转染法将其转染肺腺癌A549细胞株，在倒置荧光显微镜下观察转染结果并进行鉴定，观察细胞生长情况，检测不同时间和浓度下细胞增值特性，用MTT法检测细胞存活率，流式细胞分析术检测各细胞周期的比例，在此基础上，进一步采用RT-PCR、WesternBlot、免疫组化等方法探讨ASON作用后肺癌细胞周期基因P16的mRNA和蛋白的变化。 综上所述，本研究得出以下结论： 1.肺癌组织CyclinD1高表达，CyclinD1蛋白的过表达与NSCLC癌细胞分化程度及各型肺癌TNM分期不相关，提示CyclinD1蛋白过表达可能在肺癌发生的早期起一定作用；在肺癌组织中p27、P16与CyclinD1蛋白表达呈负相关，三者在肺癌的发生、发展过程中起一定的作用。 2.ASON能成功转染肺腺癌A549细胞，且在癌细胞内发挥抑制作用。 3.ASON能抑制肺癌细胞的生长，引起细胞发生凋亡。其抑制作用随着时间的延长和浓度的提高而增强，亦具有时间依赖性和浓度依赖性。 4.ASON能引起肺癌细胞细胞周期基因P16的mRNA和蛋白表达增高，抑制CyclinD1蛋白和mRNA表达，使细胞阻滞于G1/S期，肺癌细胞出现凋亡。
NETL