摘要
汗腺是皮肤重要的附属器之一，分为外泌汗腺和顶泌汗腺，其中外泌汗腺起着体温调节、分泌、代谢等重要作用。它由小汗腺胚芽分化而成，胚胎24周时开始分泌汗液，乙酰胆碱引起细胞内游离钙增加是人外泌汗腺腺上皮细胞分泌汗液的基础。深入研究外泌汗腺的结构和功能意义重大。第一，外泌汗腺分为分泌部和导管部，分泌部为无分支管状腺，由单层腺上皮细胞和其外周的肌上皮细胞构成，结构相对简单，但功能完整，体外培养外泌汗腺腺上皮细胞为深入研究其结构功能提供了可能，也为其它外泌腺体分泌和重吸收机制的深入研究提供了重要模式；第二，外泌汗腺分泌部和导管部均是小管结构组成，人体中还有许多器官含有小管结构，如血管、肝小管、肾小管、乳腺小管、胰腺小管等，小管起着分泌、吸收、重吸收、体液运输等重要作用，研究表明，在小管发生过程中有一些共同的作用机制，因此，体外诱导外泌汗腺小管形成和三维重建汗腺不仅有利于研究汗腺的细胞生物学和发育生物学的相关问题，对研究其它器官的小管发生和体外重建也有借鉴和指导作用；第三，汗腺重建模型的建立将为外泌腺体药理机制的基础研究等提供工具；第四，皮肤缺损导致汗腺缺失或其它疾病导致汗腺结构功能异常将严重影响患者的生活质量。组织工程皮肤发展至今，已基本解决了创面覆盖的问题，但未达到真正的组织结构和功能的完全重建，缺少毛囊、汗腺、皮脂腺等附属器，从而不能完成排汗、分泌等重要功能。体外重建汗腺将为研究带汗腺的组织工程皮肤奠定基础。 上世纪90年代始，国内外有研究者进行了外泌汗腺细胞培养方面的研究，均采用的是组织块法，体外成功培养了外泌汗腺细胞，培养的细胞保持了上皮细胞的特点和主动转运离子和水的能力以及一些药理学特性，如在拟胆碱能药(如氯化氨甲酰胆碱)的刺激下培养的分泌部细胞能形成短回路电流，该作用能被钠离子阻滞剂(阿米洛利)所抑制，这为从体外进一步研究汗腺细胞的生理功能奠定了基础。但其缺点在于获得的细胞量少，所需培养时间长，成纤维细胞污染严重，且从完整的汗腺中长出的细胞包括导管部细胞和分泌部细胞，从形态上不能鉴别。另外，体外诱导汗腺小管形成、三维重建汗腺尚未见报道。因此，建立高效汗腺细胞分离培养方法，并探讨其体外重建成为了亟待解决的重要问题。 本实验运用细胞培养、免疫组化、组织学观察、westernblot、激光共聚焦显微镜等技术手段，首先建立了外泌汗腺腺上皮细胞的高效培养方法，观察其生物学特性，及ACh和ATP对其细胞内钙的影响，然后研究了HGF对外泌汗腺腺上皮细胞生物学特性的影响，并初步探讨了在Matrigel中体外重建外泌汗腺的可能性。本实验方法、结果和结论分述如下： 方法：1、采用酶消化法分离培养了外泌汗腺腺上皮细胞，描绘了几种培养条件和接种密度下细胞的生长曲线，探索该上皮细胞最佳培养条件，观察了细胞的生长特性，免疫组化法、阿辛蓝染色和电镜观察鉴定细胞，探索了培养细胞的传代和冻存方法。 2、采用激光共聚焦显微镜观察了人外泌汗腺腺上皮细胞在乙酰胆碱和ATP的作用下，细胞内钙的变化情况。 3、MTT法观察HGF对人外泌汗腺腺上皮细胞增殖的影响，倒置显微镜和目镜测微尺观察HGF对细胞移行、传代和形态变化的影响，westernblot检测HGF刺激后p-ERK1/2、p-AKT1/2/3、p-IκBα蛋白的表达情况。 4、将人外泌汗腺腺上皮细胞种入Matrigel中进行三维培养，倒置显微镜下每天观察细胞(团)生长情况，冰冻切片后HE染色观察细胞团内部管状结构形成情况，激光共聚焦显微镜断层扫描观察细胞团立体结构和内部结构，计算机软件进行三维重建。 结果：1、人外泌汗腺腺上皮细胞最佳培养条件为2mg/mlⅡ型胶原酶消化6小时，KSFM培养，接种密度为5×104个/cm2～1×105个/cm2；3周左右细胞融合呈铺路石样生长，有“Dome”形成，免疫组化示培养的人外泌汗腺腺上皮细胞抗-EMA、抗-CK、抗-CK7、抗-CK19染色阳性，阿辛蓝染色示细胞呈紫红色染色，电镜观察可明显区分明细胞和暗细胞；培养的人外泌汗腺腺上皮细胞可传代2-3次，可冻存保存。 2、细胞外液高钙时，ACh和ATP刺激均能引起细胞内游离钙增加；细胞外液无钙时，ATP也能使细胞内游离钙增高。 3、40ng/ml和80ng/ml的HGF能显著刺激人外泌汗腺腺上皮细胞的增殖和移行，在40ng/ml的HGF的作用下，细胞的传代次数增加至5-6代，细胞形成管腔样和分支样结构，培养3天后，管腔样结构的直径为144.6±53.3μm，分支样结构的最长长度为272.5±52.5μm，与对照组相比均有显著差异。加入40ng/mlHGF后，p-ERK1/2、p-AKT1/2/3、p-IκBα均有表达，达到高峰值后又逐渐下降，但每个蛋白磷酸化高峰值时间不同。 4、人外泌汗腺腺上皮细胞在Matrigel中能生长形成类球形细胞团，9天内，细胞团直径约每两天增长一倍，11天左右细胞团直径为115.28±20.13μm，盘旋成不规则球状，形态与外泌汗腺大体结构观察相似；HE观察可见凝胶中细胞团内形成管腔结构，由一层细胞组成管壁，激光共聚焦显微镜可见细胞团内部细胞连接形成管腔结构，三维重建后可见上皮细胞呈单层排列，互相连接，围成一圈形成管壁，组成管腔。 结论：本研究建立了人外泌汗腺腺上皮细胞的快速高效分离培养方法；培养的人外泌汗腺腺上皮细胞在ACh和ATP的作用下，细胞钙通道开放，细胞内游离钙增加，具有正常的生理功能；HGF能促进该细胞的增殖、移行及形成管腔样和分支样结构，增加传代次数，可刺激ERK、AKT、IκBα相关信号通路的活化。在Matrigel中细胞能增殖成细胞团，其内部分化形成有单层上皮细胞管壁的管腔结构。本研究建立了一种高效分离培养人外泌汗腺腺上皮细胞的方法，并首次证明了外泌汗腺结构和功能重建的可能性。
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