摘要
本实验采用农杆菌介导法将商陆抗病毒蛋白(Pokeweedantiviralprotein，pAp)基因导入烟草，用捕获pBinARpap质粒的根癌农杆菌菌株LBA4404与烟草叶片外植体共培养，并在附加30mg/LKan的MS＋0.1mg/LIAA＋1.5mg/LBA的培养基上诱导植株分化，生芽后在附加30mg/LKan+O.1mg/LNAA的MS培养基上生根，实现再生植株。经过PCR检测、PCR-Southern检测、RT-PCR检测，综合抗TMV病毒试验结果，获得能够抵抗病毒侵染的工程植株.主要结果如下： 1.通过根癌农杆菌叶盘转化法，用含pBinARpap质粒的农杆菌LBA4404侵染烟草K326，同时选择了合适的Kan浓度对转化过的外植体进行筛选，经共培养，选择培养，生根培养，最终得到抗性植株，分化出苗，获得了45株抗卡那霉索的烟草植株，并全部移栽成活。 2.提取抗性植株叶片的基因组DNA，用设计的引物对45株植株进行PCR检测，结果只有一株检测到大小1000bp的目的片段。为证实扩增条带为目的产物，进行PCR-Southern检测，将PCR电泳凝胶转移到尼龙膜上，然后用地高辛(DIG)标记的PAPDNA探针进行杂交分析，结果发现探针与阳性植株PCR扩增产物产生了强烈的杂交反应，进一步证实了PCR扩增片段的确为PAP基因，杂交结果证明PAP外源基因已整合进烟草细胞核基因组中。 3.Trizol法提取阳性植株的RNA，进行反转录PCR检测，质粒DNA作为阳性对照，PCR检测阴性植株作为阴性对照，待测植株出现和阳性对照大小相同的条带，证明PAP基因在RNA水平上有表达。 4.叶片涂抹接种TMV病毒进行室内和大田抗病性鉴定，结果转基因烟草对该病的抗性明显增强。
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