摘要
国内外报道表明，纤维素酶能非专一性地水解壳聚糖，由于价格低廉，目前已替代甲壳素酶和壳聚糖酶广泛应用于甲壳聚低聚糖的生产。但其水解壳聚糖的作用是由于纤维素酶中的杂质还是纤维素酶本身引起、纤维素酶水解壳聚糖的作用方式和水解机理等方面仍不清楚。因此有必要深入探讨纤维素酶对壳聚糖水解的特性和规律，从而了解酶解机理。本论文的研究，对于进一步阐明非专一性酶水解壳聚糖的作用机理具有重要的学术意义，同时对于酶法生产甲壳低聚糖具有重要的应用价值。 本论文首先对四种商品纤维素酶水解壳聚糖的活性进行比较，从中筛选出一种水解壳聚糖活性最高的绿色木霉产纤维素酶。其水解壳聚糖的最适作用温度为60℃、最适作用pH为5.2；水解羧甲基纤维素的最适作用温度为55℃、最适作用pH为4.2。在纤维素酶水解壳聚糖的最适条件下，运用粘度法、TCL法及还原糖法等对纤维素酶水解壳聚糖的特性进行研究，结果表明壳聚糖经纤维素酶水解10min，溶液粘度下降54.5％；壳聚糖的水解反应速率与底物的脱乙酰度及底物的粘均分子量之间关系不显著；不同脱乙酰度的壳聚糖的水解产物基本一致，初期以甲壳四糖、甲壳五糖、甲壳六糖等为主，随着时间的延长，有少量甲壳二糖、单糖产生，表明纤维素酶中含有内切酶、外切酶和β-葡萄糖苷酶等多种酶。 采用DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换层析、PhenylSepharoseCL-4B疏水层析、SephadexG-75凝胶层析等方法从纤维素酶中分离纯化得到一种既具有壳聚糖酶活性又具有纤维素酶活性的酶组分CCBE，采用RP-HPLC、SDS-PAGE经银染、IEF等工作原理不同的三种方法鉴定其为一种纯酶组份。经测定CCBE相对分子质量为66,000，等电点pI接近4.45。 运用还原糖含量的测定方法，对CCBE的水解壳聚糖的酶学性质进行研究，结果表明，CCBE水解脱乙酰度90％壳聚糖的最适作用温度为60℃、最适pH为5.2；Km=0.746mgGlcN/mL，Vmax=0.0268mg/mL·min；CCBE的水解壳聚糖活性在30℃～40℃之间非常稳定，50℃作用60min相对残余酶活略有下降，60℃作用30min其相对残余酶活下降为60％，70℃和80℃作用30min，相对残余酶活急剧下降；其壳聚糖酶活性在pH4.0～7.8之间较为稳定。对CCBE水解羧甲基纤维素的酶学性质研究表明，其最适作用温度为55℃、最适pH为4.2，Km=4.078mgGlu/mL，Vmx=0.127mg葡萄糖/mL·min；其羧甲基纤维素酶活性在30℃～50℃之间非常稳定，60℃作用30min其相对残余酶活保留84％。70℃和80℃作用30min，相对残余酶活急剧下降，其纤维素酶活性在pH4.0～6.0之间较为稳定，表明CCBE水解壳聚糖和纤维素两种不同底物时酶学性质有较大差异。 金属离子Mn2+、Mg2+对酶的两种活性均有较强的促进作用，重金属对两种酶活性强烈的抑制作用，常见的金属离子(碱金属离子和碱土金属离子)对CCBE的壳聚糖酶活和CMCase酶活两种酶活性没有明显的激活和抑制作用，表明两种酶活性不依赖于金属离子。 采用已知结构的甲壳低聚糖为底物，运用TLC、HPLC及过程分析法对CCBE水解甲壳低聚糖的特性进行研究，结果表明，CCBE不能水解GlcNAc-GlcNAc之间的糖苷键，也不具有转糖苷的特性，能以β-葡萄糖苷酶的方式作用于甲壳低聚糖，从甲壳聚低聚糖的非还原端依次切下单个糖环。采用还原端基测定法对CCBE水解壳聚糖产物的还原端基，水解产物中存在GlcN、GlcNAc两种还原性端基，提示CCBE能从非还原端水解GlcN-GlcNAc、GlcNAc-GlcN、GlcN-GlcN之间的糖苷键；CCBE水解CMC、壳聚糖混合底物动力学研究表明，CCBE采用同一活性中心催化两种不同底物水解。 采用NAI、DTT、NBS、pHMB、DTNB、CHD、DEP、EDC、Ch-T、PMSF等化学修饰剂对CCBE的壳聚糖酶活性和羧甲基纤维素酶活性中心氨基酸组成进行修饰研究，结果表明：参与其壳聚糖酶活性中心的氨基酸残基主要有1分子色氨酸、2分子丝氨酸/苏氨酸、1分子的酪氨酸、1分子的组氨酸和1分子的谷氨酸/天门冬氨酸；参与其CMCase酶活性中心的氨基酸残基主要有1分子色氨酸、1分子丝氨酸/苏氨酸、1分子的组氨酸和1分子的谷氨酸/天门冬氨酸。 本论文的研究，从纤维素酶中分离纯化出一种具有羧甲基纤维素酶活性和壳聚糖酶活性的双功能组分，表明同一种酶具有两种活性是纤维素酶具有非专一性水解壳聚糖活性的重要原因之一。同时阐明了该活性组分水解壳聚糖的作用机理以及两种酶活的氨基酸中心组成。
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