Aspergillus japonicus果糖基转移酶及其改性大豆低聚糖的研究

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中文摘要：本文利用TLC和HPLC法从实验室保藏的真菌菌株中筛选到一株对蔗糖具有转果糖基作用的菌株。通过传统的形态学特性和生理生化试验，初步鉴定该菌株为曲霉属黑曲霉群。该菌最适生长温度为28-32℃，最适生长pH为5.5，在pH4-7.5范围内均能生长。利用RT-PCR技术，成功地扩增菌株的18SrDNA基因，并在Genebank数据库申请登记(登记号为AY728018)。该菌株的18SrDNA核苷酸序列全长为559bp，与GenBank中已知的真菌18SrDNA序列进行相似性分析，发现它与Aspergillusjaponicus菌株的18SrDNA序列相似性达到98.36％，因此将该菌株归类为Aspergillusjaponicus。通过急性毒理试验证明该菌株是安全的。采用紫外—LiCl复合诱变对筛选到的菌株进行诱变育种，最终获得高产菌株JN19，其产酶活力为出发菌株的1.62倍。该菌株以果糖苷物质作为碳源时，能够大量合成果糖基转移酶。蔗糖是AspergillusjaponicusJN19产果糖基转移酶的高效诱导剂，酵母膏是果糖基转移酶产生的最佳氮源，K2HPO4可以有效的促进果糖基转移酶的产生。通过响应面法确定AspergillusjaponicusJN19产酶优化培养基为(g/L)：蔗糖185.0，酵母膏18.5，K2HPO41.0，NaNO33.0，MgSO4·7H2O0.5，CMC2.0，水1000mL，pH5.5；优化的产酶条件为：初始pH5.5，摇床振荡速度150rpm，接种量10％，28℃，培养96h，果糖基转移酶活稳定在30U/mL左右。 90％以上的A.japonicusJN19果糖基转移酶存在于细胞内。该酶的最适温度为50℃，在50℃以下保温1h，果糖基转移酶活基本保持不变；最佳pH为5.5，在pH5.0-6.5范围内较稳定。多数金属离子对A.japonicusJN19果糖基转移酶有抑制作用，Cu2+、Ag+和Al3+对果糖基转移酶产生有较强的抑制作用；Mn2+对果糖基转移酶活力的影响不大；Mg2+对果糖基转移酶活具有强烈的激活作用，可以将果糖基转移酶活力提高2.2倍，说明该酶的活性维持需要金属离子的参与，最佳Mg2+浓度为0.5mmol/L。在上述条件下测定该酶的动力学常数：Km值为0.729mol/L，Vmax为84.745mol/min。葡萄糖是果糖基转移酶的竞争性抑制剂，抑制常数Ki为6.107mol/L。该酶具有高度的底物专一性，能够催化蔗糖和棉子糖等末端具有2-β-D-呋喃果糖基的糖糖苷键断裂，并以自身为受体合成新的低聚糖，但对单糖和其它双糖均无转糖基作用。蔗糖和棉子糖等含有呋喃糖环的糖是该酶的最佳受体；海藻糖能够接受果糖基转移酶转移的果糖基合成新的低聚糖。利用RT-PCR技术，成功克隆到了果糖基转移酶cDNA结构基因，并在Genebank数据库申请登记，登记号为DQ439972。利用软件分析，发现来源于AspergillusjaponicusJN19的果糖基转移酶cDNA结构基因同Genebank数据库公布的编码果糖基转移酶cDNA结构基因的同源性为97.5％。将扩增得到的果糖基转移酶cDNA结构基因与真核表达载体pYX212连接，构建酿酒酵母表达载体pYX212-FTA，表达载体转化大肠杆菌JM109，在氨苄青霉素平板上获得阳性转化子。选阳性转化子抽提质粒进行酶切验证，结果表明酵母表达载体pYX212-FTA构建成功。将含有果糖基转移酶编码基因的重组质粒电转化至酿酒酵母S.cerevisiaeW303中，利用选择性平板，筛选到了阳性克隆。并利用酵母菌落PCR技术对生长在缺陷型筛选平板上的转化子进行鉴定，以阳性克隆为酶源检测到了果糖基转移酶活力，酶活力平均为26.4U/mg。创建了一套独特的戊二醛交联固定AspergillusjaponicusJN19菌体方法。通过正交实验确定固定化条件：戊二醛浓度20mmol/L，蛋白浓度1.0％，菌体与固定液之比为1:10，固定化时间为1.5h，固定化菌体酶活平均340U.g-1，酶活保留率80％以上。将霉菌交联后使用，增加了粗酶的稳定性核反复使用次数，最适反应温度为55℃，最适温度范围变宽；最适pH6.0，在pH4.5～6.5之间，固定化后pH对A.japonicusJN19菌体稳定性没有太大影响，在偏碱环境中，固定化菌体较游离菌体稳定。经过10周的贮存，固定化菌体酶活残存84％，细胞完整状况良好。固定化菌体在间歇反应器中具有较高的操作稳定性，酶活力的半衰期为58d，完全可以满足工业化生产的要求。对固定化菌体改性大豆低聚糖的条件进行了初步探讨。在底物浓度600g/L，固定化菌体量50g/L，反应温度55℃，pH6.0，0.5mmol/LMg2+，反应时间36h条件下，酶解产物中总低聚糖含量由原来的42.69％提高到57.7％，大约有75.94％的蔗糖被转化。

作者：

王立梅

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关键词：

果糖基转移酶大肠杆菌酿酒酵母固定化大豆低聚糖

授予学位：

博士

学科专业：

粮食、油脂与植物蛋白工程

导师：

周惠明

学位年度：

2006

学位授予单位：

江南大学

语种：

中文

中图分类号：