农杆菌介导的Ac/Ds转座子大豆突变群体的构建

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中文摘要：大豆是重要的油料作物，也是人类膳食中植物蛋白质的主要来源。突变体是克隆基因和研究基因功能的良好材料，创造突变体库对于植物功能基因组学研究具有十分重要的意义。用转座因子标签法分离基因不需要预先知道被标签基因产物的结构、性质，因此那些背景尚不清楚的如发育、抗病及与生理过程有关的基因都有可能用此方法来分离。90年代由于植物组织培养与外源基因转化技术的发展，已可以将一种植物的转座因子导入到另一种植物中，并证明转座因子在异源植物中也能转座，这样用转座因子标签法来分离基因更加受到重视。目前，插入突变在植物的功能基因组研究中己得到广泛应用。众所周知，大豆的遗传转化体系建立的极其困难，其主要原因是：1.难以建立高效的植株再生体系，没有理想的适合遗传转化的再生系统。2.遗传转化效率低、重复性差。因此大豆难以象拟南芥和水稻那样通过T-DNA插入获得大量突变体。而利用Ac/Ds转座子标签技术，则只需将Ac和Ds元件分别转入大豆，通过Ac和Ds转化系的杂交，借助转座子在分离世代中的转座，获得大量的突变体，从而构建大豆突变群体。本研究利用基因工程手段，采用农杆菌介导法，探讨了提高大豆植株再生和遗传转化效率的影响因子，建立了稳定的植株再生和遗传转化体系，获得了Ac和Ds抗性转基因T0代植株940株，转基因T2代植株8000余株，在研究过程中鉴定出十几个表型突变体，并对这些表型突变体进行了初步分析，为大豆突变群体的构建、突变基因克隆和大豆功能基因组学研究奠定了基础。具体研究结果如下： 1.以吉林小粒1号子叶节为外植体，进行丛生芽诱导和农杆菌转化试验。通过优化丛生芽诱导、伸长和生根3个阶段合适的培养基配比，在6-BA浓度为1.7mg/L时，吉林小粒1号丛生芽诱导率最高，平均为93.2％。当IBA浓度达到1.5mg/L时，外植体的生根率最高，为79.8％。 2.对比实验表明氯气熏蒸的消毒方法优于升汞消毒，萌发率与消毒时间成反比。利用nptⅡ基因和hpt作为选择标记基因，在丛生芽诱导阶段Km的最适筛选浓度为50mg/L，在芽伸长阶段Km的合适筛选浓度为30mg/L。在丛生芽诱导阶段HygromycinB的最适筛选浓度为20mg/L，在芽伸长阶段HygromycinB的合适筛选浓度为10mg/L。 3.农杆菌转化实验中，当外植体保留2/3或3/3子叶时，丛生芽分化数量多、生长速度较快，对农杆菌的抑制效果也有一定影响。转化试验结果表明，共培养pH值、负压处理时间、共培养时间、预培养时间都影响转化效率，影响程度依以上顺序递减。最佳处理组合为侵染前外植体4℃低温预处理1天、侵染时0.06Mpa抽真空5分钟、共培养3天、共培养培养基pH值为5.4。 4.除菌试验中羧苄青霉素(Cb)(德国进口)和Cef(国产)，两者混合使用，农杆菌污染率一直低于单独使用Cef,丛生芽的诱导率高于单独使用Cef。此转化体系抗性芽率可达68.1％，伸长率为34.1％，生根率为27.2％，巴龙霉素离体检测阳性率为15.3％，PCR阳性率为9.4％，Southern杂交结果证明外源基因已经整合入大豆基因组。本研究建立了稳定的大豆子叶节农杆菌转化体系，同时该流程操作简便，比较适合规模化遗传转化实验。 5.本研究采用农杆菌介导的方法，以吉林小粒1号子叶节为受体材料，将玉米Ac/Ds转座子，共3个载体，成功转化到大豆基因组中。对转化植株进行了PCR检测、Southerndotblot分析、Southern杂交分析等分子生物学检测，测序结果证明Ac/Ds已经整合到大豆基因组中，共计获得转化植株940株，其中Ac转基因植株340株，DsG转基因植株300株，DsE转基因植株300株。 6.转基因材料中筛选单拷贝插入，Ac34份、Ds38份，自交纯合，获得独立起始基因系。 7.构建了Ac×Ds杂交群体，从分子水平上证明了杂交后代中转座因子在大豆基因组中的存在，且于GenBank中的数据一致。杂交群体扩繁，建立了大豆Ds突变群体。 8.转基因植株后代出现了十几种类型的可见突变体，有些属于非插入突变。利用分子生物学方法对叶形突变材料、花色突变材料、成熟期突变材料进行分析，得到突变基因的初步结论。

作者：

吴迪

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关键词：

大豆子叶节农杆菌介导转座子标签外源基因转化

授予学位：

博士

学科专业：

作物栽培与耕作学

导师：

朱延明、韩天富

学位年度：

2006

学位授予单位：

东北农业大学

语种：

中文

中图分类号：