摘要
目的： 破伤风是由破伤风杆菌侵入机体后引起的一种急性感染性疾病，主要是由破伤风杆菌产生的外毒素侵袭神经系统而导致的。目前唯一有效的防治手段是及时注射精制破伤风抗毒素(TAT)或人破伤风免疫球蛋白(TIG)，以中和血液中游离的毒素。但由于TAT存在过敏反应，而TIG血液来源困难并存在病原微生物污染等问题，使临床应用上受到了很大的限制。近年来随着噬菌体抗体库技术的建立和发展，使人源抗体的制备成为可能，从而可以在根本上解决了过敏反应、血液不足及病原微生物污染等问题。本论文利用此免疫噬菌体抗体库技术，探索制备人抗破伤风类毒素的抗体。从破伤风类毒素免疫的个体获得人Fab抗体基因，构建人Fab抗体基因库；用破伤风外毒素筛选出展示人源TAT-Fab抗体噬菌体；挑选一株在大肠杆菌中表达可溶性人源TAT-Fab抗体，并初步鉴定所制备的可溶性人源TAT-Fab抗体具有部分中和破伤风外毒素的生物活性。 方法： 1.自破伤风类毒素加强免疫者的外周血中分离单个核细胞(PBMC)，提取细胞总RNA并反转录合成cDNA；以cDNA为模板，用PCR法扩增全套人Ig轻链(κ链、λ链)基因和重链(γ链)Fd段基因。 2.自含有噬菌粒pComb3的大肠杆菌XL1-Blue中抽提并纯化载体pComb3。 3.XbaⅠ和SacⅠ双酶切混合轻链基因和噬菌粒pComb3，并从凝胶中回收纯化。T4DNA连接酶连接上述双酶切产物，电穿孔转染大肠杆菌XL1-Blue，构建人Ig轻链基因库(pComb3-L)。XbaⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定。 4.抽提纯化人Ig轻链基因库的重组噬菌粒(pComb3-L)，与混合重链Fd段基因均XhoⅠ和SpeⅠ双酶切，并从凝胶中回收纯化。T4DNA连接酶连接上述双酶切产物，电穿孔转染大肠杆菌XL1-Blue，构建人Fab抗体基因库(pComb3-HL)。XbaⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定。 5.人Fab抗体基因库与辅助噬菌体(VCSM13)共同培养得到噬菌体人Fab抗体库，经“吸附-洗脱-富集”筛选富集展示人源TAT-Fab抗体噬菌体并鉴定。 6.阳性克隆(人源TAT-Fab-pComb3)SpeI和NheⅠ双酶切，将外壳蛋白Ⅲ基因切除，变融合蛋白表达为可溶性蛋白表达，并从凝胶中回收。T4DNA连接酶连接上述双酶切产物，电穿孔转染大肠杆菌XL1-Blue，构建可溶性人源TAT-Fab抗体工程菌。 7.阳性克隆在大肠杆菌XL1-Blue表达可溶性人源TAT-Fab抗体。ELISA鉴定可溶性人源TAT-Fab抗体的亲和性；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹印迹检测(Westernblot)确定可溶性人源TAT-Fab抗体的分子量。 8.与抗人IgGFab抗体相偶联的蛋白亲和层析柱纯化可溶性人源TAT-Fab抗体，动物试验鉴定生物活性。 结果： 1.人Ig轻链(κ、λ链)基因库的构建和鉴定 3对人Igκ链和3对λ链基因特异性引物在54℃、55℃、56℃、58℃的退火温度下PCR扩增出650bp的特异性条带；将混合轻链基因克隆入噬菌粒pComb3中构建人Ig轻链基因库(pComb3-L)，库容约为7.3×105；双酶切鉴定人Ig轻链基因库构建成功。 2.人Fab抗体基因库的构建和鉴定 6对人Ig重链(γ链)Fd段基因特异性引物在58℃的退火温度下PCR扩增出700bp的特异性条带；将混合重链Fd段基因克隆入pComb3-L中构建人Fab抗体基因库，库容约为5×104；双酶切鉴定人Fab抗体基因库构建成功。 3.展示人源TAT-Fab抗体噬菌体的筛选和富集。 将人Fab抗体基因库与辅助噬菌体共同培养，建立噬菌体人Fab抗体库，滴度为1.69×1011pfu/ml；经五轮吸附-洗脱-富集后，展示人源TAT-Fab抗体噬菌体的滴度为1.3×106pfu/ml。 4.展示人源TAT-Fab抗体噬菌体的鉴定 ELISA测定证明了所展示的人源TAT-Fab抗体可以与破伤风外毒素特异性的相结合，挑选的5个克隆，在490nm处的吸光值(OD490)最高为1.68； 并对该克隆进行DNA测序，证明轻链为κ型，重链Fd为γ3。 5.可溶性人源TAT-Fab抗体在大肠杆菌XL1-Blue表达及鉴定 将上述克隆双酶切连接，电转染，构建可溶性人源TAT-Fab抗体工程菌；优化表达条件后，在工程菌的菌密度OD600为1.0时，加入IPTG0.1mmol/l，37℃诱导培养14个小时，测得细菌裂解液中可溶性人源TAT-Fab抗体的表达量最高为0.15IU/mlTIG，同时细菌上清也有此抗体的表达，为0.10IU/mlTIG；SDS-PAGE和Westernblot显示其分子量为50KD(非还原)和25KD(还原)。 6.可溶性人源TAT-Fab抗体的纯化及生物活性的鉴定 用与抗人IgGFab抗体相偶联的蛋白亲和层析柱纯化可溶性人源TAT-Fab抗体，动物试验证明其具有部分中和破伤风外毒素的生物活性。 结论和意义 1.成功建立了人抗破伤风类毒素免疫噬菌体抗体库 2.筛选获得了展示人源TAT-Fab抗体的噬菌体。 3.建立了可溶性人源TAT-Fab抗体的原核细胞表达体系，在大肠杆菌XL1-Blue表达了可溶性人源TAT-Fab抗体。 4.动物试验证明经亲和层析柱纯化后的可溶性人源TAT-Fab抗体具有部分中和破伤风外毒素的作用。 5.该研究在国内率先建立人源TAT-Fab基因工程表达体系，为下一步基因工程方法生产可溶性人源TAT-Fab抗体、防治破伤风奠定了基础。
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