摘要
全球经济的高速发展导致以石油为代表的不可再生的各类矿物质资源日益短缺，寻找可再生性能源成为必然的趋势。燃料酒精是公认的最有发展前景的可再生清洁能源之一。以木质纤维素类生物质生产燃料酒精不仅能够降低燃料乙醇生产的原料成本，同时在废物处理、环境保护等方面起到一定的作用。木糖是木质纤维素水解物中含量仅次于葡萄糖的一种单糖。木糖的有效利用是木质纤维素生物转化生产乙醇的关键环节之一。运用途经工程改造酒精生产菌株使其具有共代谢葡萄糖和木糖的能力和利用发酵工程技术优化生产工艺使重组菌株木糖代谢能力得到最大限度的发挥是转化木质纤维素类生物质资源酒精生产产业化的重要基础措施。 本文以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)工业生产菌株为出发菌株，在建立工业菌株转化体系的基础上，通过基因工程(MetabolicEngineering)手段，将木糖代谢的关键酶基因引入酒精生产酿酒酵母工业菌株中，得到了能共发酵木糖和葡萄糖产生酒精的工程菌株；运用发酵工程技术对工程重组菌株的酒精发酵工艺进行了优化，对培养基的组成和木糖代谢最大影响因素溶氧、pH等参数设计实验，进行优化，取得了较好发酵结果。主要研究内容为： 酿酒酵母工业菌株转化体系的建立。酿酒酵母工业菌株往往没有实验室酵母所具有的营养缺陷型标记，只能利用某些显性标记，而且由于不同工业菌株细胞壁结构、生理生化特征及遗传背景相差很大，转化方法也与实验室菌株的转化有所不同。本文选用酵母菌广泛适用的G418抗性基因作为显性选择标记，通过敏感度实验测定了G418作用于酒精生产菌株6508、1308、NAN-27和自絮凝酵母SPSC-1的最低抑菌浓度。发现不同菌株对G418的敏感性有较明显的差异，因此针对不同酵母工业菌株之间的差异，需要选用不同的转化子筛选体系。 酵母的自絮凝性在酒精清液发酵工艺中可以使细胞在生物反应器中实现无载体固定化，利于发酵后处理，是良好的工业生产性能。但基因操作中转化子的筛选是以单细胞菌落为基础的，因此这一特性又给其分子生物学操作带来困难，其解决措施是对絮凝酵母进行解絮凝处理。为此对絮凝酵母SPSC-1分别采用聚焦光束反射测量仪(FBRM)以机械力剪切和EDTA鳌合Ca2+解除相邻细胞壁组分的阴离子基团连接的化学法探讨了自絮凝酵母SPSC-1的解絮凝条件。研究发现物理法解絮凝效果不佳，而使用EDTA鳌合Ca2+可以较长时间地保持细胞的游离状态。通过浓度梯度的EDTA解絮凝效果实验，确定50mmol/lEDTA为SPSC-1解絮凝的最佳浓度，在去除EDTA后，酵母可以恢复原来的自絮凝特性，对酵母自身工艺特点上的优势不产生影响。 根据酒精生产对酵母菌株性状的要求，为了使外源基因在酵母中稳定表达，必需将外源基因整合到酵母工业菌株染色体上，为此构建了单拷贝整合载体pYIK和多拷贝整合载体pYMIK，载体带有PGK强启动子及G418抗性基因。pYIK的同源重组区含有URA3，pYMIK中以rDNA作为整合位点，由于rDNA在酵母染色体上有多个重复，可以满足外源基因多拷贝整合的需求。 将来自毕赤氏酵母Pichiastipitis的木糖还原酶基因(XYL1)、木糖醇脱氢酶基因(XYL2)和酿酒酵母自身的木酮糖激酶基因(XKS1)分别连接到单拷贝整合载体pYIK和多拷贝整合载体pYMIK上，得到了重组质粒pYIK-123和pYMIK-127。将之转化入酿酒酵母工业菌株，在含G418和以木糖为唯一碳源的YPX平板上筛选转化子，并通过提高G418浓度增加筛选压力和木糖生长测定的方法二次筛选，得到含有低拷贝和多拷贝木糖代谢基因XYL1、XYL2、XKS的重组酵母菌，菌株分别称为NAN-123、NAN-127。重组菌在无选择压力培养条件下酶活测定表明，木糖还原酶(XR)、木糖醇脱氢酶(XDH)和木酮糖激酶(XK)均在酿酒酵母中得到活性表达。 将NAN-123、NAN-127在氧气限量的条件下，进行木糖葡萄糖共发酵实验。工程菌与宿主菌生长实验表明外源基因的引入对菌体的生长没有影响。HPLC发酵产物分析表明各重组菌都能利用木糖产生乙醇。其中，NAN-127利用木糖生产乙醇的结果优于NAN-123和宿主菌。NAN-127对木糖的利用最高可达20.6g/L，较宿主菌提高了18.6g/L，乙醇产量最高可达9.3g/L，较宿主菌提高31％；而NAN-123利用木糖的最大值是10.1g/L，较宿主菌提高了8.1g/L，产生的乙醇最大值是8.4g/L，较宿主菌提高了18％。以上结果表明高拷贝整合外源基因的工程菌NAN-127具有较优良的发酵性能，因此我们选用其进行发酵工艺优化。 根据可利用的木质纤维素生物质水解液中葡萄糖和木糖的组成比例和酒精工业化生产对高糖醪液的需求，确定了发酵培养基中葡萄糖和木糖的比率为2∶1，浓度分别为100g/L、50g/L。采用自行改进的厌氧瓶，进行兼性厌氧摇瓶发酵，分析结果表明，工程菌株NAN-127发酵40小时即可生成大部分的酒精，之后酒精积累较为平缓；木糖的消耗贯穿整个发酵过程，发酵96小时酒精得率为0.44gethanol/gsugarconsumed，木糖利用率53.6％，大大高于常规摇瓶发酵条件下酒精得率和木糖利用率(0.16gethanol/gsugarconsumedand31％respectively)。 培养基中有机氮源的含量对木糖代谢有较大的影响，有机氮含量过高会使副产物增多且会降低酵母菌对酒精的耐受力从而影响菌株发酵性能。参考酒精生产菌株的培养基组分，进行培养基配比的优化，调整了YEPD培养基中酵母粉和蛋白胨的含量和比率，确定了小罐发酵实验的培养基配方。 对NAN-127进行小罐分批发酵实验。根据对木糖利用影响因素最大的溶氧和pH，设计了不同梯度的单因子实验。通过调节通气量和pH使酿酒酵母工业重组菌分别处于厌氧、兼性厌氧和微好氧的不同发酵状态，分析表明在通气量0.05vvm、pH4.5的发酵条件下，NAN-127的木糖利用率达到82.1％，酒精产量达到52.1g/L。与最初的发酵结果相比，工业工程菌对木糖的利用得到大大提高，木糖代谢可以较顺利的进行，证明通过发酵工艺的优化工程菌得以较高水平的发挥代谢木糖的能力，基本达到优化的目的。 对比分析了不同酿酒酵母生产菌株的耐温性、酒精耐受性。选择具有各自优良性状的1308、6508作为受体菌，用多拷贝重组质粒pYMIK-127转化，得到了多拷贝整合XYL1、XYL2、XKS1基因的工程菌株1308-127、6508-127。将NAN-127、1308-127、6508-127在优化的发酵条件(通气量0.05vvm，pH4.5)下共发酵葡萄糖和木糖，工程菌株均表现出良好的发酵性状。NAN-127、1308-127、6508-127木糖的利用率分别为82.1％、70％、和73.8％，较宿主菌分别提高了4.1、3.7和3.8倍。证明在优化条件下工业重组菌株的木糖代谢可以较顺利的完成；参数具有普遍性，从而为木糖代谢工业化生产提供了重要的参考。
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