摘要
弓形虫是一种专性细胞内寄生的原虫，能感染包括人类在内的所有哺乳动物，引起人兽共患弓形虫病。弓形虫呈世界性分布，人群感染率高达25％～50％。孕妇孕期首次感染，弓形虫可穿越胎盘屏障感染胎儿，影响其发育，重者导致畸胎、死胎，存活者也常有畸形及智力发育不全等严重后遗症，同时可使孕妇出现流产、早产。健康成人感染弓形虫多为隐性感染，但当机体免疫功能受累时，如患恶性肿瘤、艾滋病或器官移植等，弓形虫的增殖力和致病力明显增强，是其致死的重要原因。弓形虫还可引起禽畜疾病，给畜牧业生产造成严重的经济损失。迄今为止，无任何有效的防治方法。疫苗的研究成为预防与治疗弓形虫病的发展方向。 P30抗原作为弓形虫速殖子表面的主要抗原之一，具有较强的免疫原性，能够诱导机体产生IgG、IgM、IgA抗体和CD8+T细胞杀伤弓形虫，是最有希望的疫苗候选抗原。另外，弓形虫病主要通过粘膜途径感染，应用无毒性的霍乱毒素A2/B(CTA2/B)亚基作为免疫佐剂，能有效增强P30蛋白的免疫原性，可以增强免疫作用，打破免疫耐受，是研制高效的弓形虫疫苗的理想佐剂。 国内外学者曾用多种表达系统来表达P30与CTA2/B蛋白，动物和人体实验结果显示疫苗的效果不理想。原核表达系统操作简单、产量高，但缺乏真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，表达产物往往没有生物活性，质量不高。哺乳动物细胞表达系统虽能正确表达蛋白，但产量低，无法进行P30蛋白下游研究和大规模动物实验。本研究选用既具有原核生物的优点，又具有真核生物功能的毕赤酵母表达系统。迄今为止，毕赤酵母表达系统已成功地表达了400多种蛋白。酵母是单细胞真核生物，兼有细菌易培养、遗传操作简单、高效表达外源蛋白等优点，又具有真核细胞的糖基化和二硫键形成等加工和修饰作用，是表达外源蛋白的适宜宿主。本研究使用的酵母表达载体pGAPZαA是组成型表达载体，含有引导蛋白出胞的α-信号肽，可使产物分泌出胞，有利于产品的纯化和生产；利用编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的启动子，可组成性表达外源基因而不需要甲醇诱导；携带c-myc表位和多组氨酸尾，具有Zeocin抗性筛选标记基因；强效可调控启动子AOXl，能高密度发酵，外源蛋白表达水平很高，如破伤风毒索蛋白的产量达12g/L。 本研究采用分子生物学的方法，拟构建含有弓形虫主要表面抗原P30与免疫佐剂CTA2/B复合基因的克隆载体及酵母表达载体，并在毕赤酵母中表达、纯化与鉴定。方法：PCR扩增复合基因，TA克隆建立克隆载体pMD18T-p30-CTX；用亚克隆技术把P30-CTX复合基因克隆入表达载体，构建酵母表达载体pGAPZαA-p30-CTX；重组载体分别以PCR、酶切及测序鉴定；使用生物信息软件分析P30-CTX复合基因，预测编码蛋白结构。线性化重组酵母表达载体，电穿孔法导入毕赤酵母GS115，抗生素Zeocin筛选、PCR法鉴定阳性转化子；酵母工程菌摇瓶表达，取上清液进行SDS-PAGE和Westernblotting分析。结果：成功构建了含目的基因的克隆载体pMD18T-p30-CTX和酵母表达载体pGAP-p30-CTX。重组质粒经PCR、酶切鉴定正确，测序结果证实为pGAP-p30-CTX基因，序列分析同源性为99.82％，生物信息学预测P30-CTX蛋白结构折叠无明显改变。P30-CTA2/B重组蛋白在毕赤酵菌中成功分泌表达，产量高达0.57g/L；SDS-PAGE显示其在49000处有一条明显表达蛋白条带，WesternBlot结果显示表达蛋白具有P30抗原特异性，并测定蛋白纯度、浓度和产量。结论意义：大量具有免疫活性的P30-CTA2/B重组蛋白在毕赤酵母中的成功表达，为今后弓形虫亚单位复合疫苗的研制和大规模动物实验创造了条件。
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