摘要
目的：肿瘤的发生和发展与细胞凋亡及机体免疫功能的异常关系密切，通过Fas/FasL系统抵抗Fas介导的凋亡以及反击免疫细胞使 T 细胞凋亡，是肿瘤细胞免疫逃逸的重要机制之一。本课题通过对肝癌细胞株HepG2.2.15的Fas、FasL及其功能的检测，探讨肝癌细胞通过Fas/FasL途径的免疫逃逸机制；并通过分析肝癌组织细胞Fas-670位点基因多态性，探究肝癌细胞Fas表达低下的原因；通过将FasL反义寡脱氧核苷酸(ASODN)转染入肝癌细胞及将Fas ASODN转染入T 细胞，研究Fas、FasL ASODN抑制肝癌细胞诱导的 T 细胞凋亡，逆转肝癌细胞免疫逃逸的作用机制；通过干扰素．a上调肝癌细胞 Fas 表达，研究细胞因子对肿瘤细胞凋亡的促进作用。 方法：(1)流式细胞术(FCM)检测肝癌细胞HepG2.2.15表面 Fas 及FasL的表达；(2)用激活性 Fas 单抗 CHll 诱导细胞凋亡的方法研究肝癌细胞对 Fas 介导凋亡的抵抗；(3)用HepG2.2.15细胞与 Jurkat 细胞共培养法研究肝癌细胞表面 FasL 诱导 T 细胞凋亡的机制。(4)用PCR-RFLP法分析肝癌组织细胞Fas-670位点的基因多态性。(5)根据 Fas 及 FasL 基因序列设计合成特异的互补于 mRNA 起始密码区的 Fas 及 FasL ASODN，并设同长度的与 mRNA 起始密码区序列相同的正义寡脱氧核苷酸(SODN)做对照，均经硫代磷酸化修饰。根据预实验结果，选择120nmol/L、200nmol/L、280nmol/L为转染液的终浓度，通过脂质体介导法转导FasL ASODN) 入 HepG2.2.15细胞，FCM检测转导后细胞表面FasL表达的变化，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测细胞FasL mRNA的变化，用与Jurkat细胞共培养法检测肝癌细胞诱导T细胞凋亡的变化，用CH11诱导细胞凋亡的方法检测肝癌细胞凋亡的变化。用同样的方法转导Fas ASODN入Jurkat细胞，并检测转染后，Jurkat细胞表面Fas表达、Fas mRNA的表达、以及与肝癌细胞共培养后凋亡率的变化。(6)针对肝癌细胞低表达Fas并抵抗Fas介导的凋亡，用干扰素-α(IFN-α)上调细胞Fas表达，用CH11诱导细胞凋亡的方法检测肝癌细胞凋亡的变化。 结果： 第一部分：人肝癌细胞株HepG2.2.15 Fas/FasL的功能与免疫逃逸机制 肝癌细胞株HepG2.2.15细胞表面Fas表达率为1.24％；用激活性Fas单抗CH11诱导细胞凋亡的方法显示，HepG2.2.15细胞加入CH11后的凋亡率与加入同型对照IgM的阴性对照组比较无明显差异，而作为阳性对照组的Jurkat细胞加入CH11后，其凋亡率却显著增高；且实验组继发性死细胞数明显低于阳性对照组。HepG2.2.15细胞FasL的表达率为18.03％，与Jurkat细胞共培养可诱导Jurkat细胞凋亡，凋亡率为21.41％：用FasL中和抗体NOK-2封闭HepG2.2.15细胞表面的FasL后，Jurkat细胞的凋亡率下降至8.91％。 第二部分：肝癌组织Fas启动区-670位点基因多态性分析 Fas启动区-670位点对照组以AA基因型最多，而肝癌组以AG基因型最多；肝癌组AA基因型频率较对照组明显减低，AG基因型频率明显增高，GG基因型频率有增高趋势，但尚无统计学意义。肝癌组Fas-670位点G等位基因频率与对照组比较显著增高，A等位基因频率显著降低；肝癌组Fas-670位点G等位基因携带者频率较对照组显著增高。 第三部分：FasL、Fas反义寡核苷酸转导对肝癌细胞诱导T细胞凋亡的抑制作用 经FasL ASODN作用48h后HepG2.2.15细胞FasL的表达率下降，FasL ASODN浓度为120nmol/L、200nmol/L、280nmol/L的处理组FasL的表达率分别为13.07％、7.94％、5.54％，与对照组18.06％相比均有显著差异；且FasL表达率随ASODN浓度的增加而下降，呈剂量相关性。而相应浓度FasL SODN处理组FasL表达率与对照组比较均无显著差异。HepG2.2.15细胞经FasL ASODN作用后FasL mRNA水平下降，电泳图像示条带变浅，以β-actin基因作内参照，ASODN组FasLmRNA的相对表达量为0.3433，而对照组及SODN组分别为0.8023、0.8512。HepG2.2.15细胞经FasL ASODN作用后，与Jurkat细胞共培养，Jurkat细胞凋亡率下降为11.04％，与对照组21.81％比较有显著差异；而SODN组Jurkat细胞凋亡率为21.55％，与对照组比较无显著差异。但是，HepG2.2.15细胞经FasL ASODN作用后，用CH11诱导细胞凋亡，凋亡率与对照组相比无明显变化。 经Fas ASODN作用后Jurkat细胞Fas的表达率下降，Fas ASODN浓度为120nmol/L、200nmol/L、280nmol/L的处理组Fas的表达率分别为63.28％、51.53％、46.94％，与对照组87.23％相比均有显著差异；且Fas表达率随ASODN浓度的增加而下降，呈剂量相关性。而相应浓度Fas SODN处理组Fas表达率与对照组比较均无显著差异。Jurkat细胞经Fas ASODN作用后Fas mRNA水平下降，电泳图像示条带变浅，以β-actin基因作内参照，ASODN组Fas mRNA的相对表达系数为0.4229，而对照组及SODN组分别为0.8540、0.9616。Jurkat细胞经FasASODN作用后，与HepG2.2.15细胞共培养，细胞凋亡率下降为14.28％，与对照组22.17％比较有显著差异；而SODN组Jurkat细胞凋亡率为20.94％，与对照组比较无显著差异。 第四部分：细胞因子IFN-α对肝癌细胞Fas表达及凋亡的影响 HepG2.2.15细胞与IFN-α作用24h后Fas表达率明显增加，IFN-α浓度分别为2000U/ml、1000U/ml、500U/ml的A1、A2、A3三组Fas表达率分别为22.02％、l8.12％、15.04％，与对照组1.71％比较均有显著差异；且Fas表达率随IFN-α浓度的降低而降低。加入CHll后，实验组细胞凋亡率均明显增加，A1、A2、A3三组分别为l7.26％、16.16％、12.02％，与对照组5.86％比较有显著差异，且随IFN-α浓度的降低而降低。 结论： 1．HepG2.2.15细胞Fas表达低下，能抵抗FasL诱导的凋亡。 2．HepG2.2.15细胞表达有功能的FasL，可反向诱导Jurkat细胞凋亡，从而抑制T细胞的免疫功能。 3．Fas/FasL途径是肝癌细胞免疫逃逸的重要机制之一，可成为免疫治疗的新靶点。 4．肝癌组织Fas基因启动区-670位点AA型减少、AG型增高、G等位基因频率及G等位基因携带者频率增高，提示该位点A→G替换可能是肝癌Fas表达低下的原因之一，还可能是肝癌的易感因素。 5．HepG2.2.15细胞转导FasL A SODN后，FasL-mRNA降低；细胞表面FasL表达下降；与Jurkat细胞共培养，Jurkat细胞的凋亡率下降。提示FasL ASODN转导可有效地封闭肝癌细胞FasL表达而使其诱导T细胞凋亡的能力减弱，从而逆转肝癌细胞的免疫抑制作用。 6．Jurkat细胞转导Fas ASODN后，Fas-mRNA降低；细胞表面Fas表达下降；与HepG2.2.15细胞共培养后Jurkat细胞的凋亡率下降。提示Fas ASODN转导可通过有效地封闭T细胞Fas表达而阻断肝癌细胞诱导的T细胞凋亡，保护免疫细胞功能，逆转免疫抑制。 7．FasL ASODN不能直接增加肝癌细胞的凋亡，而是通过阻断肿瘤细胞对免疫细胞的破坏，间接促进肝癌细胞的凋亡。 8．经IFN-α作用后HepG2.2.15细胞Fas表达增加；由CH11诱导的细胞凋亡增加。提示IFN-α可通过上调细胞Fas表达，促进肝癌细胞凋亡，逆转肝癌细胞对Fas介导凋亡的抵抗。 9．Fas、FasL ASODN及IFN-α逆转肝癌细胞免疫逃逸的抗肿瘤作用和机制，为反应基因技术及细胞因子在肿瘤生物治疗中的应用以及丰富肿瘤治疗的方法提供了新的理论和实验依据，开辟了新的前景。
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