摘要
第一章大鼠成骨细胞的体外培养和鉴定 目的:从正常新生大鼠颅骨中分离培养大批成骨细胞并进行功能鉴定,为进一步研究作准备。 方法:将新生SD大鼠处死,无菌条件下取出颅骨,剔净后剪成1mm×1mm×1mm碎块,0.1%胶原酶消化15分钟,碎骨块接种于培养瓶中培养,通过观察细胞形态学及钙化结节、碱性磷酸酶染色进行鉴定。 结论:用改良组织块法进行大鼠成骨细胞培养,方便易行,可分离、培养大量高纯度成骨细胞,在体外传代后仍保留其表型特征,可供进一步研究使用。 第二章 尼古丁对体外培养成骨细胞骨桥蛋白表达的影响 目的:探讨尼古丁对体外培养大鼠成骨细胞骨桥蛋白表达的影响。 方法:取第四代体外培养大鼠成骨细胞,当传代细胞生长至80%汇合时,分三组分别加入尼古丁、尼古丁和阿曲库铵苯磺酸盐(筒箭毒碱)及空白,继续培养48小时。收集细胞按异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取细胞总RNA,RT-PCR分析各组成骨细胞表达OPN mRNA的差异。提取总蛋白,Western blotting法测定蛋白表达水平,免疫沉淀法检测蛋白磷酸化程度。 结论：尼古丁干预体外培养大鼠成骨细胞，其骨桥蛋白mRNA、蛋白表达水平、蛋白磷酸化程度明显增强；而阿曲库铵苯磺酸盐(筒箭毒碱)能有效地拮抗尼古丁所诱导的成骨细胞骨桥蛋白表达及磷酸化程度增强。 第三章TNF-α对体外培养大鼠成骨细胞骨桥蛋白表达的影响 目的：探讨TNF-α对体外培养的大鼠成骨细胞骨桥蛋白表达的影响。 方法：取第四代体外培养大鼠成骨细胞，当传代细胞生长至80％汇合时，分三组分别加入TNF-α、TNF-α和其拮抗剂肿瘤坏死因子结合蛋白(TNFbp)及空白，继续培养48小时。收集细胞按异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取细胞总RNA，RT-PCR．分析各组成骨细胞表达OPN mRNA的差异。提取总蛋白，Westem blotting法测定蛋白表达水平，免疫沉淀法检测蛋白磷酸化程度。 结论：经TNF-α干预的体外培养大鼠成骨细胞，其骨桥蛋白mRNA、蛋白表达水平、蛋白磷酸化程度明显增强；而TNFbp能拮抗TNF-α所诱导的成骨细胞骨桥蛋白表达及磷酸化程度增强。
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