摘要
龋病是一种细菌感染性疾病，变形链球菌是龋病的主要致病菌。免疫防龋是控制龋病的有效手段之一。近年来，利用转基因植物技术生产可食疫苗的研究日益发展。转基因植物疫苗能够通过直接口服的给药方式诱导动物和人体的粘膜和系统免疫应答，具有简单、安全、稳定、有效、经济等明显优势，日益显示出其广阔的应用前景和潜在的经济效益。 目的：在获得含编码变形链球菌表面蛋白PAcP和霍乱毒素B亚单位融合基因的转基因番茄原代种子的基础上，应用分子生物学的技术检测外源基因在转基因植株中的表达，测定目的蛋白的含量，通过免疫啮齿类动物检测其免疫原性，探索研制安全、经济的可食用防龋疫苗的可能性。 方法：本研究包括两部分： 第一部分：提取转基因番茄总DNA，PCR筛选含编码变形链球菌表面蛋白PAcP与霍乱毒素B亚单位融合基因的转基因番茄植株；提取番茄果实总蛋白，用BCA试剂盒测定番茄果实总蛋白含量；通过Western blot检测外源蛋白的表达情况，并用ELISA法对外源目的蛋白含量进行测定。 第二部分：转基因番茄可食防龋疫苗免疫啮齿类动物的研究，1、BABL／c小鼠：①分组：BABL/c小鼠18只，雌雄各半，随机分成3组，分别为实验组：即转基因番茄果汁免疫组；阳性对照组：即变形链球菌灭活全菌免疫组；阴性对照组：即非转基因番茄果汁免疫组。②免疫途径：灌胃。③免疫时间：免疫4次，每次间隔一周。④样品采集时间：分别于首次免疫前一天和每次免疫后一周采集血液、唾液样品。⑤特异性抗体的检测：血清中IgG和唾液中SIgA采用酶联免疫吸附实验(间接ELISA法)检测。⑥最后一次免疫后一周处死动物，取心、肝、脾、肺、肾进行组织病理学检查。2、SD大鼠：出生18天的SD大鼠18只，雌性，建立龋齿模型，随机分成3组，分组情况、免疫途径、免疫时间、样品采集时间及特异性抗体的检测的方法同小鼠，鼠龄70天时处死动物，并取上下颌骨，进行龋齿计分。 结果： 1.提取18株番茄总DNA，进行PCR扩增分析，其中10个样本见1.6kb扩增条带，出现特异性条带的植株占总检测植株的55.6％；转基因番茄总蛋白含量为3.93mg/ml，Western Blot显示，转基因番茄蛋白提取样本在PVDF膜上约60KD处出现了一条明显条带，提示此带是特异性条带。对照番茄蛋白样本则未见特异性条带。测得表达的目的蛋白占番茄可溶性总蛋白的0.18％； 2.免疫后，实验组和阳性对照组小鼠和大鼠血清特异性IgG水平和唾液特异SIgA水平与阴性对照组比较有统计学意义(P<0.05)；小鼠的SIgA较IgG先升高且升高明显。阳性对照组和阴性对照组在龋损各级中均有明显差异(P<0.01)，实验组和阳性对照组无统计学意义(P>0.05)，实验组和阴性对照组只在Dx级无统计学差异。 结论： 1.筛选获得了含编码变形链球菌表面蛋白PAcP和霍乱毒素B亚单位融合基因的转基因番茄子代植株，转基因番茄子代植株能有效表达外源蛋白，蛋白含量占番茄果实可溶性总蛋白的0.18％； 2.转基因番茄所表达的目的蛋白具有免疫原性，能够诱导啮齿类动物产生有效的粘膜免疫应答和系统免疫反应，能抑制龋齿的发生。
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