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硫霉素生物合成基因簇的异源表达及其改造

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碳青霉烯类抗生素是一种有着重要应用的β－内酰胺类抗菌剂，特别是对于有多种药物抗药性的细菌感染有着很好得效果。它们有着很广谱的抗菌活性并且对多数临床上遇到的β－内酰胺酶有抗性。尽管已经证实一些革兰氏阴性菌可以产生碳青霉烯类抗生素，但它们主要还是由链霉菌产生。硫霉素(Thienamycin)是第一个被分离到的碳青霉烯类抗生素。它由Streptomyces cattleya NRRL 8057产生，硫霉素被报道为最有效的自然产生的抗生素，它有着超广谱得抗细菌活性，并且对β-内酰胺酶有着极强的抗性。然而，硫霉素很不稳定，但通过化学合成的它的衍生物亚胺硫霉素(imipenem)在临床使用上是一种有着重要用途的抗生素，它与脱氢酶抑制剂西司他丁钠(cilastatin sodium)以1:1等量混合，商品名为泰能(Tienam)。目前硫霉素原始产生菌产量低，组分多，异源表达未见报道，所以我们想通过异源表达的手段来提高它的产量，并有可能对其生物合成基因簇进行改造从而创制新的抗生素。 重组工程(recombination-mediated genetic engineering)是一种快速而有效的构建载体的有力的方法，也是一种能直接的操纵细菌基因组的方法。入噬菌体的redα基因，是5'-3'外切酶，作用于双链DNA分子而产生3'突出的分子；噬茵体的redβ基因，为单链结合蛋白，其结合在DNA分子的3'突出端而防止宿主菌大肠杆菌的DNA内切酶对外源DNA的降解，redβ基因同时表现重组酶活性，即促进两个单链、同源DNA分子之间的退火；gam基因，其抑制宿主菌RecBCD外切酶的活性；recA基因，其可以提高重组酶的活性。 这里我们使用重组工程的方法，一步直接克隆含有整个硫霉素生物合成基因簇的DNA片段。首先设计含有硫霉素生物合成基因簇两端同源臂的引物，然后在Red/ET大肠杆菌中通过同源重组，然后就能得到含有整个基因簇的质粒。尔后我们又对质粒做了改造，也是通过重组工程的方法对质粒上基因簇的一个基因(thnF)进行了新基因(Asm10 N-methyltransferase甲基转移酶，Formiminotransferase亚胺基转移酶)替代。

谢锋

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硫霉素 生物合成基因簇 异源表达 甲基转移酶 亚胺 新基因 质粒 同源重组 Rcd 引物 设计 片段 直接克隆 酶的活性 抑制 退火 酶活性 时表 降解 外源

硕士

微生物学

尚广东

2008

南京师范大学

中文

R9