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重楼总皂苷作用人肝癌细胞系HepG2的蛋白质组学研究

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目的：通过研究重楼总皂苷(Rhizoma Paridis total saponin，RPTS)对人肝癌细胞株HepG2蛋白质表达谱的影响，寻找RPTS抗肿瘤作用的相关蛋白。 方法：①按照皂苷提取方法制备RPTS。②MTT比色法检测RPTS对HepG2细胞增殖的影响，流式细胞仪(Flow cytometry，FCM)分析RPTS处理HepG2细胞后凋亡和细胞周期的改变。③应用固相pn梯度(ImmobilizedpH gradient，IPG)双向凝胶电泳(Two-dimensional electrophoresis，2-DE)技术分离RPTS处理组(IC50浓度作用48h)和对照组HepG2细胞的总蛋白，胶体硝酸银染色，图像扫描获取处理组和对照组总蛋白质的2-DE图谱后，使用ImageMaster软件分析比较两组间差异表达的蛋白质，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption/ionizationtime-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)测得经胶内胰酶酶解的差异蛋白点肽质量指纹谱(Peptide mass fingerprint，PMr)，用Mascot软件查询NCBI蛋白质数据库。 结果：①成功获取RPTS并经TLC、HPLC等方法鉴定。②RPTS对HepG2细胞增殖具有抑制作用，并呈剂量和时间依赖关系。MTT法提示RPTS作用HepG2细胞48h的IC50为10±1.2μg/ml。FCM检测发现RPTS能够诱导HepG2细胞凋亡，引起HepG2细胞S期阻滞。③根据MTT分析和FCM检测结果，选择10μg/ml RPTS干预HepG2细胞48h进行蛋白质组学(Proteomics)分析，所获2-DE图谱分辨率较高、重复性较好。RPTS处理组和对照组平均蛋白质点数分别为1690±25和1 700±39，平均匹配的点数分别为1394±17和1421±13，匹配率达82.5％和83.6％。RPTS处理组与对照组不同胶之间蛋白质点在等电聚焦(Isoelectric focusing，IEF)方向的偏差是1.232±0.218mm，在十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)方向上的偏差为1.126±0.142mm。两组间共有51个差异表达蛋白点，RPTS处理组有31个蛋白质点下调，20个蛋白质点上调。选择表达量差异较明显的15个差异点(差异2倍以上)行质谱分析，获得15张PMF图谱，经查询数据库初步鉴定12个蛋白质，部分蛋白与肿瘤发生、发展、进展相关，如dUTP焦磷酸酶(dUTP pyrophosphatase，dUTPase)，异种核糖核蛋白K(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K，hnRNP K)，GMP合酶(GMP synthase)，脱氧核糖核酸内切酶Y(DNasegamma)，核苷酸二磷酸激酶A(Nucleoside diphosphate kinase A，NDKA)等。 结论：RPTS对HepG2细胞增殖具有抑制作用，并且能够诱导细胞凋亡和影响细胞周期。RPTS抗肿瘤作用可能与dUTPase，hnRNP K，GMPsynthase，DNase gamma，NDKA等蛋白直接或间接相关，通过对这些蛋白的深入研究，将有助于进一步阐明RPTS抗肿瘤作用机制及肿瘤治疗药物新型靶点的发现。 [

程志祥

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重楼 总皂苷 人肝癌细胞系 蛋白质 rate incubation treatment inhibiting effect concentration dependent HPLC Results databases identify differential protein Mascot flight mass spectrometry laser ionization time

博士

肿瘤内科学

刘宝瑞

2008

南京医科大学

中文

R9