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摘要
目的:膀胱癌是泌尿系统常见肿瘤，目前对膀胱癌的治疗主要有手术、放疗、化疗等多种方法，但疗效尚不能使人满意。探讨新的疗法十分必要。肿瘤的发生发展与基因的改变密切相关，基因治疗就是试图通过针对基因物质的作用达到治疗肿瘤的目的。近年来肿瘤的基因治疗发展迅速。uroplakin是尿路上皮特异性糖蛋白，前列腺干细胞抗原(prostate stem cell antigen，PSCA)在膀胱癌高表达而在正常组织低表达。本研究的目的就是通过前列腺干细胞抗原增强子(prostate stem cell antigen，enhancer，PSCAE)和尿路特异糖蛋白Ⅱ(uroplakin Ⅱ，UPⅡ)启动子构建膀胱特异性溶瘤腺病毒载体以寻求膀胱癌靶向治疗的新方案。 方法：通过Western-blot检测UMUC-3，5637，HepG2，PC3，LNCAP，BGC823和NHU细胞PSCA和AR的表达。通过PCR技术获得前列腺干细胞抗原增强子PSCAE和uroplakin Ⅱ的启动子(UP Ⅱ promoter)。通过酶切从质粒pBK-CMV-Luc获得荧光素酶报告基因Luc，从质粒RpS-TOAD-PSE-PBN-E1A酶切获得E1A基因，并将PSCAE，UP Ⅱ，Luc，E1A和无编码对照序列Null定向连接入穿梭质粒，构建出质粒RpS-UPⅡ-E1A；RpS-E-UPⅡ-E1A；RpS-UPⅡ-Luc；RpS-E-UPⅡ-Luc；RpS-UPⅡ-Null；RpS-E-UPⅡ-Null。利用同源重组原理获得腺病毒质粒Ad-E-UPⅡ-E1A、Ad-UPⅡ-ElA、Ad-RpS-E-UPⅡ-Null：Ad-RpS-UPⅡ-Null。并且通过脂质体转染的方法用质粒Rp-UPⅡ-Luc和Rp-E-UPⅡ-Luc转染膀胱癌细胞T24，UMUC-3，5637，和非膀胱癌细胞HepG2，PC3，BGC823以及尿路上皮细胞NHU。pCMV-β-gal作为内参照。转染后在含有雄激素或雄激素受体拮抗剂的培养液中培养，24小时后裂解细胞并检测细胞裂解液内萤光素酶活性和半乳糖苷酶活性，以荧光强度与半乳糖苷酶反应后吸光度的比值作为校正的萤光素酶活性。将腺病毒质粒线性化后转染293细胞，包装成腺病毒颗粒。鉴定后分别感染膀胱癌细胞进行溶细胞活性观察。 结果：①本研究构建的质粒均通过PCR和酶切双重鉴定来确定产物正确。 ②通过Western-blot检测T24，UMUC-3，5637，HepG2，PC3，LNCAP，BGC823和NHU细胞中PSCA和雄激素受体AR的表达，膀胱癌细胞T24，UMUC-3，5637和前列腺癌细胞PC3，LNCAP以及胃癌细胞系BGC823都高表达PSCA。NHU和肝癌细胞HepG2呈现PSCA低表达。膀胱癌T24，和5637细胞AR+，而膀胱癌UMUC-3细胞AR-。前列腺癌细胞LNCAP为AR+，而前列腺癌细胞PC3为AR-，NHU细胞AR-。③经Rp-UPⅡ-Luc质粒转染膀胱癌细胞和尿路上皮细胞都可以导致较高的萤光素酶活性表达，但在非泌尿系来源性细胞中表达较低，差异有显著性。经Rp-E-UPⅡ-LUC质粒转染后也可以导致膀胱上皮癌细胞中萤光素酶活性明显高于非泌尿系统来源细胞的表达，差异有显著性(P<0.01)。Rp-E-UPⅡ-LUC转染后膀胱癌细胞中萤光素酶活性明显高于正常尿路上皮表达，差异有显著性(P<0.01)。PSCAE置于UPⅡ上游可以提高膀胱癌细胞中萤光素酶活性而在正常尿路上皮细胞和其他组织来源肿瘤细胞中却不增加其活性表达。④雄激素受体激动剂R1881可以提高Rp-E-UPⅡ-LUC转染后的AR阳性膀胱癌细胞T24和5637中萤光素酶活性，而对AR阴性膀胱癌细胞UMUC-3中不能明显提高其萤光素酶活性。雄激素受体阻断剂Flutamide不能使Rp-E-UPⅡ-LUC在AR阴性和阳性细胞活性下调。R1881和Flutamide对Rp-UPⅡ-LUC在膀胱癌中萤光素酶活性影响不明显。R1881和Flutamide对Rp-UPⅡ-LUC和Rp-E-UPⅡ-LUC在非膀胱癌细胞中活性的影响不明显。⑤将腺病毒包装后获得的腺病毒Ad-Rp-E-UPⅡ-E1A转染膀胱癌细胞T24后能够导致明显的细胞病变并最终裂解肿瘤细胞。 结论：uroplakin Ⅱ启动子能够驱动目的基因在膀胱癌中高表达，而在其他组织来源肿瘤细胞中低表达，具有组织特异性。PSCAE能够增强uroplakin Ⅱ启动子在膀胱癌细胞中的活性而在非尿路上皮来源细胞和正常尿路上皮细胞中增强作用不明显。雄激素受体激动剂可以在AR阳性膀胱癌细胞中提高PSCAE活性而在AR阴性膀胱癌细胞中和正常尿路上皮以及其他组织来源肿瘤中却不能。雄激素受体阻断剂不能完全阻断PSCAE活性，说明PSCAE具有部分雄激素非依赖特性。基于PSCAE和UPⅡ启动子的溶瘤腺病毒Ad-Rp-E-UPⅡ-E1A可以有效裂解膀胱癌细胞。
关键词
膀胱癌细胞/病毒/丁酸钠/抗癌药物/灌注治疗/增强/生长/膀胱肿瘤/结论/治疗组/比例/抑制率/敏感性/化疗药物/处理细胞/协同作用/用具/表达上调/癌细胞凋亡/染色显示引用本文复制引用
授予学位
博士学科专业
外科学导师
王志平学位年度
2008学位授予单位
兰州大学语种
中文中图分类号
R73