摘要
普那霉素是由始旋链霉菌产生的一种链阳性菌素类抗生素，对包括甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌、万古霉素耐药的肠球菌等在内的大多数革兰氏阳性菌均具有较强的杀菌活性，且抗生素后效应较长，被专家们视为治疗顽固性革兰氏阳性菌感染的特选药物。目前，普那霉素的生产水平较低，远不能满足临床上的需求。本文将围绕如何提高普那霉素的产量和质量，对StreptomycespristinaespiralisXC416的发酵工艺、普那霉素的分离纯化工艺等进行较为系统的研究，并探索采用树脂吸附的原位分离技术与发酵相耦合生产普那霉素的新工艺。研究了S.pristinaespiralisXC416的摇瓶发酵条件。通过单因素试验和以响应面为主的统计学方法对发酵培养基进行了优化，优化后的发酵培养基组成为：可溶性淀粉65.45g/L，葡萄糖9.30g/L，豆饼粉10g/L，蛋白胨5g/L，鱼粉10g/L，酵母粉3g/L，(NH4)2SO41.5g/L，MgSO4·7H2O4.93g/L，KH2PO40.2g/L，NaNO30.75g/L，CaCO34g/L。优化后的摇瓶培养条件为：种龄48h，接种量8%，摇瓶装液量25mL/250mL，发酵初始pH值6.5～7.0，温度23℃，摇床转速为240rpm。在此条件下，S.pristinaespiralisXC416的摇瓶发酵产量达到了490.7mg/L。以生物反应与分离耦合的集成化思路为指导，建立了以JD-1大孔吸附树脂直接从发酵液中吸附分离目标产物的原位分离技术并祸合普那霉素发酵的新方法。在S.pristinaespiralisXC416摇瓶发酵45h时添加8%(w/v)JD-1树脂，普那霉素的产量达到了1353mg/L，JD-1树脂对普那霉素的吸附容量约为13.5mg/g。在5L发酵罐上对S.pristinaespiralisXC416分批发酵的代谢规律进行了研究，确定了采用分两阶段控制溶氧水平的分批发酵工艺，使普那霉素的产量达到了604.mg/L。并在此基础上建立了普那霉素分批发酵的形态学结构模型，该模型能较好地反映普那霉素的发酵过程。同时以模糊理论为基础建立了S.pristinaespiralisXC416的模糊生长动力学模型，普那霉素发酵过程的生长生产耦合度为1.64%，为典型的非生长耦联过程。建立了对发酵液中的普那霉素进行分离纯化的硅胶柱层析方法。优化后的柱层析操作条件为：选用100～200目的硅胶，二氯甲烷：乙酸乙酯：乙醇=80：35：5(V:V)为洗脱剂，流速为2.0mL/min，普那霉素的进样浓度为2.26g/L，硅胶的总负载量约为0.81mg/g，温度为25℃。在此条件下分离所得产品的纯度约为965，回收率约为97%。通过制备高效液相色谱法对硅胶柱层析分离后得到的产品进一步纯化精制，最后制备得到了纯度在99%以上的普那霉素ⅡA纯品，并运用紫外光谱、红外光谱、核磁共振和质谱等多种现代波谱学方法对所制备的普那霉素ⅡA纯品进行了结构鉴定。探索了采用扩张床吸附分离异位耦合发酵生产普那霉素的新工艺。采用游离菌体的耦合模式，发酵液的粘度过高，导致形成“直通槽”等不利于床层稳定的因素，阻碍了耦合操作的顺利进行。采用固定化菌体的耦合模式，虽然有利于降低发酵液的粘度，使床层较为稳定，但在启动耦合操作24h之内发酵液即被杂菌污染，致使耦合操作仍无法顺利进行。
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