在植物花粉发育过程中，大量基因参与小孢子发育、花粉壁构建、有丝分裂、减数分裂、花粉填充物合成等活动，这些基因高度有序的表达是获得可育花粉的必要条件和重要保证，基因突变或者环境条件改变都有可能影响花粉发育，甚至引起雄性不育。为研究白菜(Brassica campestris L.ssp.chinenesis Makino，syn.B.rapa ssp.chinenesis)Polima核质互作雄性不育系‘Bcpol97-05A’、Ogura细胞质雄性不育系‘Bcogu97-06A’与其共同的保持系‘Bcajh97-01B’蕾期基因表达差异，我们采用cDNA-AFLP技术和ATH1 GeneChip研究三个材料蕾期基因的表达情况，分析并揭示在相同核背景下两胞质不育材料蕾期基因表达的异同，为花粉发育利植物雄性不育提供分子依据。在此基础上，我们利用RACEs(rapid amplification of cDNA ends)利同源克隆等方法从‘矮脚黄’白菜及近缘十字花科植物中克隆了一些重要基因。 (1)利用cDNA-AFLP技术分析‘Bcpol97-05A’、‘Bcogu97-06A’与‘Bcajh97-01B’蕾期基因表达差异，获得了98条阳性差异转录片段(transcript-derived fragments，TDFs)，在‘Bcpol97-05A’与‘Bcajh97-01B'花蕾特异表达61条，‘Bcpol97-05A’花蕾中特异沉默30条，‘Bcpol97-05A’花蕾特异表达的12条。‘Bcogu97-06A’与‘Bcajh97-01B'花蕾存在差异TDFs有75条，其中在‘Bcogu97-06A’花蕾中特异沉默的40条，‘Bcogu97-06A’花蕾特异表达的8条。98条阳性TDFs中，21条在保持系‘Bcajh97-01B’中特异表达，4条仅在‘Bcogu97-06A’花蕾中特异表达，8条仅在‘Bcpol97-05A’花蕾中表达。这些TDFs代表的基因涉及细胞壁合成与调控、防卫与胁迫反应、电子传递和能量途径、普通新陈代谢、蛋白质代谢、信号转导、转录调控和转运通道等方面． (2)利用拟南芥Affymetrix全基因组芯片ATH1 GeneChip研究‘Bcpol97-05A’、‘Bcogu97-06A’和‘Bcajh97-01B’蕾期基因表达差异，共得到688个差异表达基因。338个基因在两不育系中上调，352个基因在两不育系中下调。在上调基因中，63个基因为两不育系所共有，其中有大量的叶绿体、线粒体基因参与上调表达，‘Bcpol97-05A’材料特有的上调基因有94个，其中24个为叶绿体或线粒体基因，‘Bcogu97-06A’材料中特异上调基因有116个，其中4个为叶绿体和线粒体基因；在338个下调基因中，75个基因在两不育系中共同下调，在‘Bcpol97-05A’中下调的基因有93个，‘Bcogu97-06A’材料中下调的基因有109个。借助拟南芥Affymetrix全基因组基因芯片，获得了比cDNA-AFLP技术更为丰富的差异表达信息。 (3)以‘Bcpol97-05A’和‘Bajh97-01B’为材料。根据cDNA-AFLP技术获得一条长约330 bp的特异序列P1708，RT-PCR验证确认该序列仅在不育白菜材料中表达，经测序和BLAST比对．发现该片段与叶绿体trnL和ndhJ基因之间的一段序列完全一致，并有54 bp的重复序列。根据trnL和ndhJ 基因两端的保守序列设计全长引物，分别以不育白菜及其原保持系的cDNA为模板，获得了长约2,000 bp的序列，该序列包含trnL、trnF和ndhJ等三个基因的完整序列，比对两序列发现：不育白菜‘Bpol97-05A’中除108 bp的插入序列外，另有多个位点发生变异。 (4)富含脯氨酸蛋白(proline-rich protein，PRP)是构成细胞壁的一类重要结构蛋白，在花粉发育过程中，也同样需要这类蛋白。根据cDNA-AFLP获得的差异表达片段B0610，利用RACEs技术在‘Bajh97-05B’中克隆到了基因全长，定名为白菜花药特异富含脯氨酸蛋白(Brassica campestrisAnther-specific Proline-rich Protein，BcAPG)基因。基因编码区长1,731 bp，编码576个氨基酸，推导的蛋白质序列中，脯氨酸残基含量极高，占总氨基酸数量的22.4％。另外，我们从6种十字花科植物中克隆到了它的同源基因，所推导的氨基酸与NCBI中已知的PRP相比，序列存在较大差异，推测这些基因产物属于一类新的PRP。RT-PCR结果表明，该基因仅在可育的Ⅲ级、Ⅳ级和Ⅴ级花蕾中表达，其它各级花蕾及营养器官中均未检测到，而且，在两个不育系中的所有花蕾均未见表达。进一步实验表明，仅在花药中检测到BcAPG的表达，而花丝、花瓣、花柱和花萼中均未见表达，推测可能在白菜花粉壁的构建中起着重要作用。 (5)拟南芥MS2与雄性不育密切相关，基因芯片数据分析表明，三个白菜材料在MS2探针上存在差异，保持系‘Bajh97-01B’中检测到较强的杂交信号，而两个不育系中信号缺失。利用同源克隆技术，分别从‘Bajh97-01B'叶片基因组DNA和混合花蕾cDNA中克隆到了MS2同源基因的DNA和cDNA全长，命名为白菜雄性不育2(Brassica campestris Male Sterility 2，BcMS2)基因。BcMS2的DNA全长为2,576bp，具8个外显子和7个内含子，编码区长1,851 bp，编码616个氨基酸，蛋白质C端含有一个微体目标信号序列Gla-Arg-Ala，该蛋白位点与微体特异结合。RT-PCR结果显示，BcMS2仅在可育材料的Ⅲ级花蕾中表达，其它各级花蕾及营养器官中均未能检测到，在两不育材料的所有部位都没有表达，进一步研究表明，BcMS2的表达具有花药特异性。 (6)肌动蛋白是细胞骨架微丝系统的重要组成部分，在花粉发育及花粉管伸长过程中，肌动蛋白的活动十分活跃。是花粉可育和花粉管顺利生长的重要保证。根据已知序列，设计全长引物，从混合花蕾cDNA和叶片基因组DNA中克隆到了各自的全长，基因命名为BcACT(Brassica campestrisActin)基因。其DNA全长为1,704 bp，具3个内含子，编码区长度为1,134 bp，编码377个氨基酸。基因表达结果显示，BcACT基因在保持系‘Bajh97-05B’和Polima不育系‘Bpol97-05A’的花蕾中表达，但表达模式存在差异，而在Ogura不育系‘Bogu97-06A’未见表达。此外，BcACT基冈的表达具有花药特异性，随着花药的成熟，表达量逐渐增加。 (7)根据基冈数据库已有的拟南芥profilin 4及其同源基因设计简并引物，在白菜花蕾cDNA中成功克隆到前纤维蛋白基因，命名为白菜前纤维蛋白(Brassica campestris Profilin，BcPRO)基因，基因库中的登陆号为EF492988。BcPRO编码区由405个核苷酸组成，编码134个氨基酸，推导的氮基酸序列与甘蓝型油菜和拟南芥的花粉前纤维蛋白分别有95％和92％的同源性。RT-PCR表明，BcPRO仅在保持系的Ⅲ级、Ⅳ级和Ⅴ级花蕾及Polima雄性不育系的Ⅲ级和Ⅳ级花蕾中表达，并且表达量逐级增大，而在莲座叶、花茎叶、茎、根及Ogura雄性不育系的所有部位均未能检测到。进一步研究发现，BcPRO在花药中表达，在萼片、花丝、雌蕊、花瓣等部位均朱见表达。这些实验结果表明，BcPRO为花药特异基因，可能在发粉发育过程中起着重要的作用，并且在相同核背景下，有着不同的核-质互作模式。 (8)基因芯片研究白菜材料蕾期基因表达差异时，发现拟南芥的一个查尔酮合成酶基因探针的杂交信号有显著差异，保持系‘Bcajh97-01B’和Ogura细胞质雄性不育系‘Bcogu97-06A’有较强的杂交信号，而Polima核质互作不育系中没有检测到相应信号。根据基因数据库中已发布的拟南芥及其同源基因序列，设计了全长扩增引物，成功克隆出该基因，命名为白菜查尔酮合成酶(Brassica campestrisChalcone Synthase，BcCHS)基因。该基因在NCBI基因数据库中的登陆号为EF101136。BcCHS基因的编码区全长为1,188 bp，编码395个氨基酸，基因组DNA全长为1,263 bp，具一个长75 bp的内含子。BcCHS在保持系‘Bcajh97-01B’和Ogura细胞质雄性不育系‘Bcogu97-06A’的Ⅳ级、Ⅴ级花蕾及开放的花朵中表达，进一步研究表明，BcCHS在花药和花瓣中表达，在花朵的其它部位没能检测到。此外。在白菜白花突变体基因组DNA中克隆到BcCHS-wf,基因与野生型白菜BcCHS基因相比，发现了两个突变位点，在推导的氨基酸序列中，相应位置编码精氨酸的AGA和编码丝氨酸的AGC均替换成了甘氨酸。
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