摘要
目的:人乳头状瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)是严格的嗜上皮病毒，人是其唯一的宿主。现已明确HPV不但和女性宫颈良、恶性肿瘤有着直接的联系，还常常导致口腔粘膜、食道、咽喉、气管、结膜等部位的病变，该病毒的高危亚型还往往和鳞状上皮细胞的恶变密切相关。目前针对HPV的研究大都围绕HPV的癌基因E6、E7展开，而针对E5基因的研究鲜有报道。E5一般存在于在高危型HPV，而在导致良性肿瘤的低危型HPV中经常缺失，这一特点可能和高危型HPV的致癌作用具有潜在联系。为了明确E5在HPV致病过程中的作用，本文对HPVl6E5基因进行了初步研究，首先克隆HPVl6E5基因，并对其进行原核表达，再进一步构建了E5的真核表达载体，成功转化工程菌。这些初步研究结果为我们深入分析E5基因的功能提供了材料和理论依据。方法:①E5基因的PCR扩增与克隆：通过比较高危型HPV全序列，在E5的上下游保守区设计一对引物，PCR扩增反应后回收纯化，连接到pMD18-T载体，克隆并测序。再根据测序结果设计扩增E5的引物(分别含有BamHI，HindlII限制性酶切位点)，PCR反应，产物回收纯化，获得带有酶切位点的E5基因片段，序列分析；将HPVl6E5连接到质粒pGEM-lT中，构建质粒pGEM-T-E5，双酶切，测序鉴定。(原核表达载体的构建：分别回收，纯化双酶切后的HPVl6E5DNA和原核表达载体pET32a(+)片段，连接回收产物，构建成原核表达载体pET32a-E5，利用酶切及测序方法进行鉴定。③E5融合蛋白的诱导表达：挑取含原核表达载体pET32a-E5的单菌落接种LB培养液，摇床培养过夜。次日按一定比例将菌液接种于新鲜LB培养液，摇床上继续培养，加入IPTG，合适温度下诱导培养(诱导温度，培养时间等视实验结果而调整)。收集细菌并行超声波粉碎菌体，离心分离上清和沉淀。12.5%SDS-PAGE电泳分析蛋白表达结果，并进行Western-blot检测。④真核表达载体的构建：设计带有一对酶切位点(HindlIl，BamHI)的HPVE5引物，分别回收，纯化双酶切切下的HPVl6E5DNA以及真核表达载体pI.EGFP-N1片段，连接回收产物构建成真核表达载体pLEGFP-Nl-E5，利用PCR扩增、酶切和测序方法进行鉴定。结果:成功获得HPVl6E5基因，构建了含HPVl6E5基因的克隆质粒和原核表达载体。酶切和测序鉴定表明，克隆质粒和原核表达载体多克隆位点两端连接处及插入片段序列正确。在大肠杆菌BL21中经诱导表达和超声破碎纯化，12.5%SDS.PAGE电泳后，进行Western-blot检测，可见明显的分子量约26kD的条带，证明了HPVE5具有良好的抗原性。构建了含HPVl6E5基因的真核表达载体，测序证明插入片段及酶切位点正确。结论:①成功获得HPVE5基因片段，经过序列分析，明确其应属于HPVl6亚型。②成功构建原核表达载体pET32a-，E5和真核表达载体pLEGFP-N1-E5④在大肠杆菌BL21中表达和纯化了HPV16E5蛋白。④初步摸索并建立了制备HPV16E5蛋白的一套实验方法，为进一步研究HPV16E5的功能奠定了基础。
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