摘要
萜类化合物(Terpenoids)是植物天然产物中最大的一类化合物，其结构和功能高度多样化，迄今已有30000多种植物来源的萜类化合物。植物萜类化合物具有重要的生物学功能，作为光合色素的类胡萝卜素是自然界分布最为广泛的一类色素，总数达600多种。不少类胡萝卜素具有VA原和抗癌活性，因而是人和动物食物中不可缺少的成分。香叶基香叶基焦磷酸合成酶(GGPPS)催化15碳的FPP和5碳的IPP缩合生成20碳的GGPP，GGPP作为类胡萝卜素合成的直接前体，它的合成在类胡萝卜素的代谢中起着尤为关键的作用。为研究甘薯类胡萝卜素生物合成的分子机理和为甘薯类胡萝卜素代谢工程提供靶点，用RACE技术从甘薯(Ipomoeabatatas(L.)Lam.)新品种“渝苏303”中克隆了GGPPS基因全长cDNA，并且对该基因进行了生物信息学分析、组织表达谱分析和功能验证。克隆的甘薯GGPPS基因(GenBank(R)登录号：EU570195；IbGGPPS)cDNA全长1368bp，其长度1089bp的开放阅读框(ORF)编码长度为363个氨基酸残基的GGPPS蛋白(IbGGPPS)。生物信息学分析显示IbGGPPS及其编码的蛋白与已知GGPPS基因和蛋白序列同源。IbGGPPS序列包含GGPPS蛋白典型的两个富含天冬氨酸的域，这两个富含天冬氨酸域是和GGPPS活性有重要作用的焦磷酸结合位点。亚细胞定位预测IbGGPPS定位于质体。将IbGGPPS与来源于被子植物和裸子植物的GGPPSs构建分子发育树，结果表明GGPPSs在进化树上分为被子植物和裸子植物两大类，IbGGPPS隶属被子植物的一枝。利用半定量RT-PCR技术对IbGGPPS进行组织表达谱分析，结果表明IbGGPPS在薯块和嫩叶中表达量最高，在成熟叶片和根中表达量次之，在茎中则检测不到IbGGPPS的表达。用lbGGPPS的ORF序列替换pTrcAtIPI质粒上的拟南芥IPI基因编码区，获得pTrcIbGGPPS质粒；在大肠杆菌XLl-Blue中同时导入pACCAR25ΔcrtE质粒和pTrcIbGGPPS质粒，构建了其β-胡萝卜素的合成途径。该菌在颜色互补平板上菌落呈现明亮的橘黄色。结果表明，IbGGPPS编码的蛋白具有典型GGPPS的功能。对IbGGPPS的克隆分析和功能鉴定研究，有助于在分子遗传学水平上了解IbGGPPS的功能，并对研究甘薯类胡萝卜素前体合成的分子机理有一定帮助。转化体筛选方法的研究是植物基因工程中的一个重要课题，运用抗草甘膦基因作为筛选标记基因是一种廉价、安全、高效的筛选方法。草甘膦是目前使用最广泛的一种非选择性广谱除草剂，它是EPSPS酶的竞争性抑制剂，阻止莽草酸转为分支酸，抑制芳香族氨基酸的合成。将草甘膦不敏感型：EPSPS酶基因导入植物后，可使植物获得草甘瞵抗性。同时莽草酸途径只存在于植物和微生物，抗草甘膦基因对人体是非常安全的。本研究用携带植物表达载体pASM12的根癌农杆菌LBA4404对半夏进行叶盘法转化；在选择培养基中加入10mg/L的草甘膦进行筛选，获得草甘膦抗性的再生植株；对再生植株进行PCR.检测，幼叶的转化频率达23％，叶柄的转化频率达33％，对PCR阳性植株进行草甘膦抗性实验，多数植株在不同程度上表现出对草甘膦的抗性。本实验建立了半夏的遗传转化方法及草甘膦筛选的转化体系。为培育抗除草剂的半夏新品种及草甘膦筛选体系在半夏基因工程中的应用奠定了基础。
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