摘要
嗜热菌(thermophiles)具有独特的基因类型、生理机制、代谢机制及产物，不仅是科学研究的理想材料，而且在食品、化学、医药工业、环境生物技术、能源利用、生物转化及抗生素生产等领域都具有广泛的应用潜力。腾冲热海热田位于北纬24°57’，东经98°26’，海拔高度为1120-1893m，是我国三大地热区之一。全区目前发现有64处地热活动区，气泉、温泉群共有80余处。多项研究显示腾冲地热的热泉中蕴涵着丰富的微生物多样性。 实验研究表明，自然界中约有1％的微生物可通过传统培养方法进行培养和分离，而大部分微生物类群不能被分离和认识。因此，应用免培养法(culture-independent approach)研究地球上高温地热环境中的微生物多样性具有重要的理论和实际意义。为了更加深入的了解腾冲热海热泉中微生物群落结构和组成，同时进一步完善本实验室的免培养分析法，本研究从狮子头热泉周围采集到不同颜色不同性质的7个菌席样品，应用DGGE分析法和rRNA法研究其中的微生物群落结构和物种多样性，探讨了高温微生物与环境的相互关系，阐述了部分类群在生态系统中可能的功能与地位。 首先，运用4种方法分别对7个菌席样品进行环境总DNA提取，结果显示，除方法Ⅰ外，其余三种方法提取的DNA质量都较好，被用于后续DGGE分析的操作。对方法Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ提取的7个菌席样品的环境总DNA采用降落PER和在不同退火温度进行扩增两种思路进行细菌16S rDNA V9高变区的扩增，扩增产物经纯化后进行DGGE分析，结果显示：菌席样品中存在着丰富的微生物物种组成；不同的DNA提取方法对不同样品提取的效果不同，某一特定的方法能更加准确的反映某一个微生物群落物种的丰富程度；在多个退火温度下进行PCR扩增合并产物的DGGE图谱较降落PCR扩增的产物的DGGE图谱所得的条带数量多、亮度大，携带信息多，更能全面、准确地反应不同菌席样品的微生物物种组成；方法Ⅲ对于所有样品来说，提取效果较好，偏差较小，被用于后续研究的操作。 其次，应用rRNA法研究了狮子头(SZT)菌席样品的微生物多样性。运用方法Ⅲ从7个菌席样品中提取总DNA，用细菌16S rDNA通用引物，经PCR扩增出16S rDNA的近全序列片断，连接转化进入大肠杆菌以构建克隆文库，通过限制性酶切分析(RFLP)和克隆筛选，选出80个克隆子进行序列测定。将测序所得序列进行有效验证后，剔除4个无效序列。根据相似性小于97％为一个OTU的原则，将76个克隆子归属为39个OTU。通过计算，狮子头细菌克隆文库的Coverage C值为96.1％，Rarefaction曲线也趋于饱和。经系统发育分析，将39个OTU归属为8大类，分别是Chloroflexi(green nonsulfur bacteria)(63.3％)，Cyanobacteria(13.0％)，Proteobacteria(7.7％)，Bacteroidete(3.4％)，Acidobacteria(0.5％)，Actinobacteria(4.3％)，Chlorobi(1.4％)和Candidate division(6.3％)。其中许多类群与已分离到的纯培养细菌有较大差别而与未培养的类群聚在一起，14个类群与其最相近的序列的相似性小于90％。同时，有6个类群分类地位不明。这些结果都表明狮子头热泉菌席里存在着大量潜在的分类地位较新的细菌。最后，运用DGGE和rRNA法对狮子头菌席中的古菌微生物进行研究。通过DGGE分析发现，菌席样品中存在着一定的古菌多样性，但没能通过PCR扩增出古菌16S rDNA目的片断，故未进行后续研究。 综上所述，狮子头菌席样品中存在着丰富的细菌微生物多样性，并且许多类群与已分离得到纯培养菌有较大的区别，可能是潜在新的类群。同时，亦存在着一定的古菌多样性。本研究为进一步的纯培养研究提供了指导，为微生物资源的开发和保护提供了较为有用的信息。
NETL