摘要
目的：探讨双层壳聚糖(CS)/羟基磷灰石(HA)复合支架作为骨软骨组织工程支架的可行性。 方法：1 CS/HA支架分二步制成。烧结法制作羟基磷灰石(HA)支架(成品购于四川大学)，取3％的壳聚糖溶液倒在置入模具中的HA支架上，-20℃冰箱预冻10h，冻干机中冷冻抽干24h制作双层壳聚糖(CS)/羟基磷灰石(HA)复合支架，傅立叶红外光谱、扫描电镜、液体置换法测定其理化性质。无菌胸骨穿刺针从胫骨上段采取日本大耳白兔的骨髓约4ml，全骨髓培养法分离纯化骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells BMSCs)，10％胎牛血清的L-DMEM作为细胞培养基，在37℃、体积分数为5％的CO2及饱和湿度条件下培养，每周换液两次。取P2代骨髓问充质干细胞，免疫细胞化学测定其细胞表面抗原CD44、CD45，以用作对骨髓间充质干细胞的初步鉴定。P2代自体骨髓间充质干细胞为种子细胞，运用纤维蛋白胶种植技术，以双层壳聚糖(CS)/羟基磷灰石(HA)复合支架为载体，制作成细胞-支架复合体，扫描电镜检测细胞在支架内的分布。36只3月龄日本大耳白兔36膝，取右膝股骨滑车负重区制作成骨软骨缺损模型，直径大小约4 mm，深3mm。实验分为三组，修复骨软骨缺损模型，每组12只膝，实验(A)组：BMSc+支架，对照(B)组：单纯支架，对照(C)组：未治疗，分别于6w，12w取材，进行大体观察、组织学检测，改良Wakitani法评分软骨修复效果，比较各组修复效果差异。结果：1 CS/HA支架的理化性质：CS层孔隙率为76±5.01％，孔径为200-400 μm，平均为300 μm左右，孔相通性好，HA层孔隙率为72±4.23％，孔径直径为200-500 μm，平均为350 μm左右，孔相通性好，傅立叶红外光谱仪测定的数据表明复合支架组成物有典型的CS和HA峰，没有发现有聚乙二醇峰。2全骨髓法培养骨髓间充质干细胞，第10-14天可见集落形成，14天传代，细胞贴壁生长，呈成纤维样。免疫细胞化学检测细胞表面抗原CD44(+)，CD45(-)，与文献报道一致。 3扫描电镜观察BMSCs接种在CS/HA支架上10h后，附着在壳聚糖支架上，生长较好，并未完全伸展开来，附着在HA支架的MSCs部分伸展开来，并伸出细胞突起。实验动物术后1周恢复正常活动，观察期间动物无膝关节肿胀、感染、死亡。术后12w大体观察显示，A、B组基本修复软骨缺损，修复区表面平整光滑，与周围正常软骨不易区分，但A组的再生组织是不透明的，与周围宿主骨结合好。B组的再生组织是白色的，与周围宿主骨界限清楚。C组的再生组织是不规则的和凹凸不平的。组织学观察：A组表面有成熟的软骨组织，细胞数量多、体积相对较大，出现柱样排列的细胞群，见典型的软骨陷窝样结构和同源细胞群，软骨周围为染色均一的玻璃样基质，修复组织甲苯胺蓝异染性强，可以认为是透明软骨修复为主。软骨下骨区可见HA仍未完全吸收，未见CS样物，炎症细胞较6W时少，有少量骨小梁长入，B组可见软骨细胞较6W时增多，仍由纤维样组织修复软骨缺损，软骨下骨区可见少量的未降解的HA内有大量的炎性细胞和少量的新生组织。C组软骨区与软骨下区均由增生纤维组织填充。改良Wakitani评分显示实验组在6周、12周2个时间点的评分结果，均优于两对照组，且差异有统计学意义(P<0.05)。结论：双层壳聚糖(CS)/羟基磷灰石(HA)复合支架可作为骨软骨组织工程支架，结合BMSc可修复软骨与骨的缺损，重构膝关节解剖结构的形成。
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