摘要
目的:研究雷帕霉素对体外培养的人皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16体外增殖的抑制作用，初步探讨雷帕霉素抑制鳞癌细胞生长的可能机制，为雷帕霉素临床治疗皮肤鳞状细胞癌提供理论和实验依据。 方法:人皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16常规培养于含10％小牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养液中，在37℃，5％CO2及饱和湿度培养箱中培养。将雷帕霉素用培养液稀释成终浓度为50nmol/L、100nmol/L、150nmol/L、200nmol/L。 1、细胞增殖测定：用不同浓度的雷帕霉素处理Colo-16细胞，以四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测雷帕霉素对Colo-16细胞体外增殖的影响。 2、细胞凋亡检测：①AnnexinV-FITC和PI双染流式细胞术(FCM)检测不同浓度雷帕霉素处理后Colo-16细胞凋亡率；②Hoechst33258荧光染色法观察凋亡细胞的形态学变化；③免疫细胞化学技术(ICC)分别测定不同浓度雷帕霉素处理后Colo-16细胞Bcl-2、Bax蛋白表达水平；④免疫印迹法(WB)测定不同浓度雷帕霉素处理后Colo-16细胞Stat3、P-Stat3、Caspase-3蛋白表达水平；⑤半定量逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)测定不同浓度雷帕霉素处理后Colo-16细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA的表达；⑥统计学分析。 结果: 1.增殖抑制作用：不同浓度(50nmol/L、100nmol/L 150nmol/L、200nmol/L)的雷帕霉素分别作用12、24、48、72小时后对Colo-16细胞体外增殖均具有抑制作用，这种抑制作用与雷帕霉素的作用时间和剂量呈明显的时效和量效关系，每组抑制率在不同时间与阴性对照组相比差异均有统计学意义。 2.诱导凋亡作用 ①FCM检测结果显示雷帕霉素显著增加Colo-16细胞的早期凋亡，雷帕霉素(50nmol/L、lOOnmol/L、150nmol/L、200nmol/L)作用48h后诱导Colo-16细胞的早期凋亡率分别为7.26％±0.26％、8.34％±0.19％、9.86％±0.14％、11.92％±0.15％，与对照组1.53％±0.09％比较，差异有显著性，且Colo-16细胞早期凋亡率与雷帕霉素浓度呈剂量依赖性。 ②Hoechst33258荧光染色法显示随着实验组给药浓度的增加荧光染色可见细胞核染色质凝聚、边集、核裂解的形态学改变。 ③免疫细胞化学染色结果显示：随着雷帕霉素浓度的增加，Colo-16细胞中Bax表达率逐渐增高，Bcl-2表达率逐渐减少，与阴性对照组相比，差异均有统计学意义。 ④Western blot检测结果显示雷帕霉素作用48h后，Colo-16细胞中Stat3、P-Staff、Caspase-3蛋白的含量降低。 ⑤RT-PCR检测结果显示雷帕霉素作用48h后Bcl-2 mRNA表达显著下调，而Bax、Caspase-3 mRNA的表达显著增强。 结论: 1.雷帕霉素能够抑制皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞体外增殖，可能通过诱导凋亡途径发挥作用。 2.雷帕霉素诱导Colo-16细胞凋亡机制：雷帕霉素可通过抑制Colo-16细胞Stat3、P-Stat3的表达，抑制Bcl-2的表达、促进Bax的表达，升高Bax/Bcl-2比率，促进Caspase-3的活化，诱导Colo-16细胞凋亡。
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