摘要
背景： 随着社会经济发展、生活节奏加快、生活方式的改变以及人口老年化程度的增加，糖尿病的发病率在全球范围内呈快速增长。目前全球已诊断的糖尿病患者超过1.5亿人，预测到2025年将增至3亿人，患病率将增长27％[1-2]。我国糖尿病流行形势严峻，到2002年止，20岁以上大城市人群的糖尿病患病率从1996年的4.58％增长到6.37％，中小城市人群的糖尿病患病率则从3.37％增长到3.89％[3]。成为继心脑血管疾病、肿瘤之后的又一严重危害大众健康的慢性非传染性疾病。 糖尿病是以高血糖为特征的代谢紊乱性疾病，常伴有重要脏器的功能和结构的改变，严重威胁着糖尿病患者的生活质量，其中大血管、微血管病变常是糖尿病患者致残和早亡的主要原因。糖尿病并发症的发生和发展与高血糖密切相关。传统观点认为，高血糖导致微血管和大血管病变主要通过以下4条途径实现：多元醇通路活性增高、晚期糖基化终末产物形成增加、蛋白激酶C激活和氨基己糖通路活性增高。已有大量的基础研究和临床试验证实，使用通路特异的抑制剂均可改变糖尿病引起的血管异常。然而长久以来并没有一条共同通路将4者相互联系起来。 近年来，越来越多的证据表明高糖、氧化应激与糖尿病及其并发症密切相关。Brownlee[4]教授经过长期研究，提出了糖尿病并发症的共同机制学说，其核心是高糖引起线粒体中超氧阴离子(superoxideanion，O-2)生成过多，导致组织细胞中发生氧化应激，而氧化应激可激活上述四个途径，引起细胞功能紊乱，最终导致糖尿病的各种并发症的发生。 线粒体呼吸链是细胞内活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)产生的主要位点，是氧化应激的根源[5]。绝大多数哺乳动物细胞里，ROS主要由葡萄糖与脂肪等营养物质在线粒体的代谢过程中产生。正常情况下，机体产生的ROS能被超抗氧化酶迅速清除。当机体处在慢性高血糖和脂肪代谢紊乱状态下，线粒体ROS生成增加，当增加的ROS超过机体清除能力，即可形成氧化应激，造成机体组织细胞的损伤。由于线粒体DNA位于呼吸链附近，极易受到氧化损伤，进而形成恶性循环，氧化应激得以放大。ROS主要是通过引起蛋白质非酶促反应、膜脂质过氧化和线粒体DNA损伤等途径导致线粒体的结构和功能的损害，并进一步触发ROS大量产生。有研究证实糖尿病存在着明显的氧化应激，糖尿病机体或动物模型的胰岛β细胞[6]、血管内皮细胞[7]、心肌[8]和骨骼肌[9，10]等ROS增多，并出现细胞结构损伤、功能异常；线粒体增殖、肿胀、变性、空泡化等氧化损伤改变。 研究表明，糖尿病时动脉壁ROS产生增多，而ROS的重要来源之一是血管壁炎症部位的单核细胞[11]。由此可推测糖尿病患者ROS超载必将导致外周血单核细胞氧化应激的发生，线粒体结构和功能损伤。为证实这一推测，本研究利用电子显微镜技术对2型糖尿病(type2diabetesmellitus，T2DM)及合并大血管病变患者外周血单核细胞(PeripheralBloodMononuclearCells，PBMC)线粒体的超微结构进行观察和定量分析，并对T2DM患者外周血单核细胞线粒体结构的改变与年龄、病程、体重指数(bodymassindex，BMI)、糖代谢、脂肪代谢等因素的相关性进行初步探讨，为糖尿病线粒体损伤机制研究提供依据。 目的： 对2型糖尿病及合并大血管病变时外周血单核细胞线粒体超微结构进行观察和分析，探讨外周血单核细胞线粒体超微结构改变与年龄、病程、BMI、糖代谢、脂肪代谢等因素的相关性，为糖尿病线粒体氧化损伤机制研究提供依据。 方法： 1、以符合ADA1997年诊断标准的2型糖尿病患者15例和健康人10例为研究对象，按有无大血管并发症把糖尿病组分为T2DM无大血管病变组(5例)和大血管病变组(10例)两亚组。收集15例患者病史、体重指数等临床资料。 2、抽取空腹12小时以上静脉血5ml，检测糖化血红蛋白(HbA1C％)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)等生化指标。 3、抽取空腹12小时以上静脉血5ml分离纯化PBMC，形成单核细胞团块，经固定、脱水、包埋后，制成70nm超薄切片，置PHILIPS-CM10型电子显微镜电镜下观察、摄像。 4、观察单核细胞形态、胞浆、细胞器等，重点观察线粒体形态与数目。统计每个细胞的正常线粒体、变性线粒体、完全空泡化线粒体数。计算每例线粒体总数的平均数、线粒体变性率及空泡化率。 5、应用SPSS13.0统计分析软件对结果进行处理。实验数据计量资料以均数±标准差(x±s)表示。各组间比较采用t检验、方差分析和秩和检验，组间两两比较采用LSD法和Tamhane'sT2法，多因素分析采用多元逐步回归法。检验标准α定为0.05。 结果： 1.正常对照组PBMC表面有皱褶和微绒毛，胞质及细胞器丰富，线粒体、粗面内质网、溶酶体结构清晰，并有许多吞噬泡。线粒体存在轻度变性和空泡化现象，且程度与年龄呈正相关(P=0.002，P=0.043)。 2.T2DM患者PBMC存在超微结构的损伤改变，且改变以线粒体明显。单核细胞的改变主要表现为胞体增大，粗面内质网肿胀；溶酶体，特别是次级溶酶体数目增多；线粒体数目增多、肿胀、嵴紊乱、模糊或溶解或嵴间隙增宽、部分空泡化或完全空泡化。 3.T2DM无大血管病变组的PBMC线粒体总数、线粒体变性程度和线粒体完全空泡化程度均高于正常对照组，且差异有显著性(P=0.006、P=0.003和P=0.008)；T2DM合并大血管病变组的PBMC线粒体总数、线粒体变性程度和线粒体完全空泡化程度均高于正常对照组，且差异有显著性(P=0.000、P=0.000和P=0.000)。 4、T2DM有大血管病变组的PBMC线粒体变性率、空泡化率略高于T2DM无合并大血管病变组，但差异无显著性。 5.T2DM无大血管病变组PBMC线粒体总数与HbA1C、TG呈正相关(P=0.001，P=0.030)，线粒体变性程度与HbA1C呈正相关(P=0.008)，完全空泡化程度与TG呈正相关(P=0.014)；T2DM伴大血管病变组PBMC线粒体总数与病程正相关(P=0.040)，线粒体变性程度和线粒体完全空泡化程度均与TG呈正相关(P=0.000)。 结论： 1、随着年龄增长，正常对照组外周血单核细胞线粒体氧化损伤加重。 2、2型糖尿病患者外周血单核细胞线粒体存在氧化应激性损伤。 3、随着糖尿病病程延长、高血糖和脂肪代谢紊乱的持续，外周血单核细胞线粒体氧化损伤加剧，可能是糖尿病血管并发症发生的病理基础。
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