摘要
大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，严重威胁人类的生命健康。本研究用基因芯片技术筛选三株具有不同转移潜能的结肠癌细胞株的差异表达基因，从中挑选出Tspan-5作为研究对象，从分子和细胞水平深入探讨该基因对结肠癌细胞转移能力的影响，旨在研究对大肠癌转移相关基因，不仅有利于阐明大肠癌转移的分子机制，而且还能为临床上预测转移、基因治疗和预后判断寻找新的有效靶点。 一、基因芯片技术筛选三株具不同转移潜能的结肠癌细胞株的差异表达基因，确定研究目的基因，验证基因芯片检查结果 1、确定三个细胞株转移能力的差异用异质粘附实验和趋化运动实验确定LST-R1、SW480和Lovo三个细胞株之间转移能力的差异。异质粘附实验的粘附介质用collagenIV，细胞浓度为1×108／L，37℃、50mL／LCO2孵育1h。趋化运动实验用8μm孔径的transwell小室，趋化因子用NIH3T3细胞培养上清制备，调整细胞浓度为1×108／L，按200μL／上室加入细胞悬液，下室每室加500μLNIHSTS细胞培养上清，37℃、50mL/CO2孵育6h。结果显示，LoVo、SW480和LST-R1三个细胞株基底膜粘附性有差异，F=84.279，P<0.001。其中，LST-R1粘附细胞数显著少于LoVo(P<0.001)和SW480(P<0.001)，LoVo的粘附细胞数多于SW480(P<0.01)。粘附性强弱顺序为LST-R1<SW480<LoVo。同时，这三个细胞株总体运动性有差异，F=48.786，P<0.001。其中，LST-R1运动性弱于LoVo和SW480(P<0.001)，SW480运动性弱于LoVo(P<0.001)。运动性强弱顺序为LST-R1<SW480<LoVo。提示LoVo、SW480和LST-R1细胞株的转移潜能存在差异。 2、基因芯片以一对样本的信号平均值>2或个<2而另个>10；信号值变异系数<0.33；信号平均值有2倍以上表达差异作为判定基因差异表达的标准。在显著表达上调的基因中与转移相关的基因主要有：发动蛋白2(Dynamin2)、ADP-核糖基化因子1(ARF1)。在显著下调表达的基因中，与转移有关系的有跨膜4超家族成员9(transmenbrance4superfamily9，TM4SF9)，又称四分子交联体5(Tetraspan-5)。Tspan-5在结肠癌中的表达，为本研究首次报道，选择该基因作为研究对象。 3、基因水平验证基因芯片结果用半定量RT-PCR技术，结果显示Tspan-5mRNA在三个细胞株中的表达水平差异与基因芯片检测结果相符。 4、蛋白水平验证基因芯片结果细胞免疫化学技术定性，免疫印迹技术、免疫荧光技术结合流式细胞仪技术定量研究。结果显示TSpan-5蛋白表达水平差异与基因芯片检测结果相符。 5、临床大肠癌组织样本免疫组化研究：Tspan-5表达水平在正常大肠粘膜和息肉呈低表达或阴性，在有不典型增生的腺瘤组织中，Tspan-5表达相对于正常大肠粘膜和息肉开始升高，而在大肠癌组织中显著升高，同时转移癌的表达水平高于原发癌(Z=109.859，P<0.001)。Tspan-5表达水平高的病人3年生存率低于Tspan-5表达水平低的病人(X2=6.237，P=0.013)。 二、体外实验观察改变Tspan-5表达水平对结肠癌细胞株转移相关生物学行为的影响 1、克隆LoVo细胞Tspan-5基因，转染LST-R1细胞，构建稳定表达细胞系构建Tspan-5／pEGFP-C1重组质粒，用Lipofectamine2000TM.转染入LST-R1细胞，同时转染pEGFP-C1质粒做对照。转染后的LST-R1细胞在300μg／mLG418培养环境里稳定存活。Western-Blot检测显示转染Jspan-5／pEGFP-C1重组质粒的LST-R1中有Tspan-5-GFP融合蛋白表达，而转染pEGFP-C1质粒的LST-R1细胞则无。激光共聚焦显微镜证明表达的Tspan-5GFP融合蛋白定位在细胞膜上，而GFP蛋白则定位在胞浆。 2、RNAi下调LoVo细胞Tspan-5表达设计shRHA片段，构建质粒，用Lipofectamine2000TM导入LoVo细胞中，构建稳定细胞系，干扰Tspan-5表达。免疫蛋白印迹检测证明干扰成功，LoVoTspan5／453和LoVoTspan-5／372细胞Tspan-5蛋白表达水平显著下降。选择干扰效果最明显的LoVoTspan5／453进行下一步研究。 3、异质粘附实验实验结果显示：改变Tspan-5表达水平后，细胞基底膜主要成份CollagenIV、FN、LN、VN粘附能力均发生改变，上调Tspan-5表达可增强细胞基底膜粘附性，下调Tspan-5表达则降低细胞的基底膜粘附性，其中改变Tspan-5表达水平对CollagenIV的粘附能力降低最明显。 4、趋化运动实验实验结果显示：改变Tspan-5表达水平后，细胞CollagenIV、FN、LN、VN趋化运动能力均发生改变，以CollagenIV为明显。上调Tspan-5表达可增强细胞运动性，下调Tspan-5表达则降低细胞的运动性。 5、划痕实验实验结果显示：改变Tspan-5表达水平后，大肠癌细胞在CollagenIV上的划痕愈合能力发生改变，下调Tspan-5表达可显著抑制大肠癌细胞在CollagenIV上的划痕愈合能力。 三、整合素与Tspan-5的相互作用 l、整合素功能阻断和激活单独阻断整合素β1和Tspan-5表达，LoVo细胞的CollagenIV粘附能力下降分别为65％和55％，联合阻断后，LoVo细胞的CollagenIV粘附能力下降64％：单独激活整合素β1表达，LoVo细胞的CollagenIV粘附能力上升40％，激活已阻断Tspan-5表达的LoVo细胞，其CollagenIV粘附能力上升38％。联合阻断Tspan-5和整合素β1，其抑制LoVo细胞的CollagenIV粘附能力的作用没有明显叠加；阻断Tspan-5的表达，对激活整合素β1的LoVo的CollagenIV粘附能力无明显影响。此研究结果提示，Tspan-5对大肠癌细胞的CollagenIV粘附能力的主要与整合素β1有关。 2、Western-Blot敲低Tspan-5表达对整合素β1的表达无显著影响，但可以显著抑制PIP2的表达。 3、免疫共沉淀大肠癌细胞株LoVo和SW620中，整合素β1可以被Tspan-5抗体沉淀。 4、免疫荧光双染色Tspan-5和整合素β1在大肠癌细胞株LoVo和SW620中存在共定位。 四、体内实验观察Tspan-5敲除对大肠癌细胞裸鼠肝转移能力的影响脾脏保留法建立裸小鼠肝脏转移模型，用LoVoTspan-5／N和LoVoTspan-5／453细胞，3周处死小鼠，HE染色，光镜下见癌细胞呈团块状分布，无腺腔样结构，胞浆丰富，核大不规则，核仁明显，可见多核瘤巨细胞，核分裂像易见，符合低分化腺癌的结构特征(图3-9)。虽然敲除Tspan-5表达未能阻止转移发生，但是LoVoTspan-5／453组肝脏表面结节数低于LoVoTspan05／N(Z=-2.259，P<0.001) 通过以上研究可以得出以下结论： 1、LST-R1、SW480及LoVo细胞株具有不同转移潜能，LoVo>SW480>LST-R1。 2、LST-R1、SW480、LoVo细胞Tspan-5表达水平有差异，LoVo>SW480>LST-R1。 3、Tspan-5的表达水平与大肠癌的进展呈正相关，Tspan-5表达高的病人3年生存率低于Tspan-5表达水平低的病人； 4、改变Tspan-5表达水平可以改变结肠癌细胞株的基底膜粘附性、运动性和侵袭性。上调Tspan-5表达水平可以增强基底膜粘附性，下调则相反。 5、敲除Tspan-5表达可以抑制大肠癌细胞在裸鼠体内的肝转移。 6、Tspan-5与整合素β1有相互作用，整合素β1可能是Tspan-5复合物的成份之一。
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