摘要
海藻糖是一种非还原性二糖，它广泛存在于自然界中，具有独特的理化性质和生物学功能，使其在食品工业、化妆品工业、医药工业、农业、分子生物学等领域有广泛的应用前景。海藻糖合成酶能够通过分子内的转糖苷作用转化麦芽糖生成海藻糖，是海藻糖合成最重要的途径之一。 利用PCR技术从恶臭假单胞杆菌S1中成功扩增出海藻糖酶基因(treS)基因。通过TA克隆，将扩增片段与pMD19—T载体连接，转化E.coliJM109，蓝白斑筛选阳性菌落，得到重组质粒pMD—TS2。质粒经酶切鉴定、测序后，用BamHI、HindIII同时双酶切重组质粒pMD—TS2和表达载体pQE30T，在T4DNA连接酶作用下，构建重组质粒pQE—TS2。酶切鉴定后，将重组质粒pQE—TS2转化EcoliM15并进行了IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析，酶蛋白的分子量大小为77KD，但主要以包含体的形式存在于宿主细胞中。 通过在摇瓶条件下的优化，得到最佳培养和诱导条件为：37℃菌体生长至OD60≈0.6时，加入诱导剂IPTG至终浓度0.01mmol/L，20℃诱导20h，目的蛋白的表达量达可占可溶性总蛋白18.6％，发酵液酶活达到1.9U/mL，为原始菌株的50倍。通过单因素优化实验，得到经济适用、易于扩大培养重组菌的培养基配方：葡萄糖10g/L，硫酸铵3g/L，蛋白胨1.5g/L，柠檬酸1.5g/L，磷酸二氢钾12.5g/L，MgSO4·7H2O1g/L,TES5mL/L，pH为7.0。在5L台式搅拌发酵罐中，控制溶氧在30％以上，重组菌的对数生长中期流加碳源和氮源，发酵结束菌体干重为17.2g/L，目的蛋白的表达量占胞内可溶性蛋白的10.2％，单位体积内高密度发酵的海藻糖合成酶表达量是摇瓶发酵的6.9倍。 重组海藻糖合成酶能够一步法将底物麦芽糖转化成海藻糖。通过对缓冲液pH，温度，反应时间，底物浓度，加酶量对麦芽糖转化率的影响研究，得到了该酶最适pH8.5，最适温度20℃，在30℃以下和pH7.5～9.0之间保持较好的稳定性，并需在低温下保存。通过正交实验考察加酶量、pH、底物浓度、反应温度等因素，确立了海藻糖合成酶最佳的转化条件为：在10℃、pH8.5条件下反应36h、加酶量是6U/g麦芽糖，按此可以获得70.1％的海藻糖产率。
NETL